W****C
发帖数: 1937 | 1 可以不用同位素标记吗？ 合成的蛋白量用抗体能测到吗？ 比如是比较常规的FLAG 或
MYC抗体 |
i******m
发帖数: 495 | 2 feasible
或
【在 W****C 的大作中提到】
: 可以不用同位素标记吗？ 合成的蛋白量用抗体能测到吗？ 比如是比较常规的FLAG 或
: MYC抗体
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W****C
发帖数: 1937 | 3
你做过？ 用的哪家的试剂盒？
【在 i******m 的大作中提到】
: feasible
:
: 或
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l**********n
发帖数: 201 | 4 Promega TNT systems.
1ul in 50ul rxn can be detected by anti-Flag Ab.
use 10ul for co-ip as the starting point. |
w********r
发帖数: 1431 | 5 可以不用同位素。
不过有些蛋白表达比较差，你得往里面加点Mg或者K优化一下条件，做WB才能看到比较
清楚的band。
同位素就比较敏感，就算表达得比较差，信号也会比较强。
或
【在 W****C 的大作中提到】
: 可以不用同位素标记吗？ 合成的蛋白量用抗体能测到吗？ 比如是比较常规的FLAG 或
: MYC抗体
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y******8
发帖数: 1764 | |
W****C
发帖数: 1937 | 7 我用promega的表达了一个质粒 用抗体可以检测到了， 但是貌似量很低 要用强的ECL
才能测到， 我还是担心做IP的时候量不够 会被洗掉。
另外做coip的时候是把两个质粒一起放进去表达好， 还是单独表达再混起来好呢？ |
W****C
发帖数: 1937 | 8
我用了10ul才刚刚能测到表达。。。。
【在 l**********n 的大作中提到】
: Promega TNT systems.
: 1ul in 50ul rxn can be detected by anti-Flag Ab.
: use 10ul for co-ip as the starting point.
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W****C
发帖数: 1937 | 9
mg或者K加多少？
能不用同位素的话 还是尽量不用吧。
【在 w********r 的大作中提到】
: 可以不用同位素。
: 不过有些蛋白表达比较差，你得往里面加点Mg或者K优化一下条件，做WB才能看到比较
: 清楚的band。
: 同位素就比较敏感，就算表达得比较差，信号也会比较强。
:
: 或
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w********r
发帖数: 1431 | 10 K从25-175mM，
Mg从0.5-2.5mM，要自己试。
test用5ul做反应就可以，HA,M2,Myc WB都可以看到。
我还加了点RNase Out,这些反应的优化条件网上有，你可以去找找。
【在 W****C 的大作中提到】
:
: mg或者K加多少？
: 能不用同位素的话 还是尽量不用吧。
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k*********a
发帖数: 49 | 11 土鳖的问一句：如果俩蛋白mw差得比较多，IP完了之后为啥要用ab看是否能被pulldown
，直接autoradio有prey何bait两条band不行么
或
【在 W****C 的大作中提到】
: 可以不用同位素标记吗？ 合成的蛋白量用抗体能测到吗？ 比如是比较常规的FLAG 或
: MYC抗体
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W****C
发帖数: 1937 | 12
pulldown
爱惜生命 远离放射源：）
【在 k*********a 的大作中提到】
: 土鳖的问一句：如果俩蛋白mw差得比较多，IP完了之后为啥要用ab看是否能被pulldown
: ，直接autoradio有prey何bait两条band不行么
:
: 或
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j**********k
发帖数: 296 | 13 s35应该还好（部分人说它比p32还“危险”，见仁见智），用个挡板、在自己bench上
做就可以（不用挡板、半米外也基本安全，according to safety protocol）。
【在 W****C 的大作中提到】
:
: pulldown
: 爱惜生命 远离放射源：）
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W****C
发帖数: 1937 | 14 我试了两个质粒都表达了。 虽然低一些， 感觉还是可能用普通的IP来测的， 反正先
试试普通的， 不work再换s35.
继续问是两个质粒同时加一个体系里表达好呢 还是先分开表达 在混起来好？ 我倾向
与分开表达， 但是又没啥特别的理由哈。 |
W****C
发帖数: 1937 | 15
pulldown
不幸， 我这两个蛋白分子量差别只有1KD. 不过这也不影响用S35， 可以只标记其中一
个。 主要还是辐射污染。 用了放射性的， 每一步都变得很麻烦 很小心。。。
【在 k*********a 的大作中提到】
: 土鳖的问一句：如果俩蛋白mw差得比较多，IP完了之后为啥要用ab看是否能被pulldown
: ，直接autoradio有prey何bait两条band不行么
:
: 或
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W****C
发帖数: 1937 | 16 invitro系统的蛋白浓度有100mg/ml 做IP的话用ripa稀释？ |
i*****i
发帖数: 30 | 17 这里有几个概念：
1. in vitro expression: myc-tagged protein-A IP Flag-tagged protein-B 这是普
通IP过程。
2，如果分开表达的WHOLE CELL LYSIS做IP，那说明这2个蛋白相互作用更加直接(对上
下游信号要求不严格)，很可能是一级结构结合。
反之，就是需要正确折叠或者磷酸化修饰等二级三级结构。
3. 一起转染表达的话，根据表达量来决定IP需要的WCL ug数.最常见IP：400-500ug
WCL加1ug抗体。 |
