e****p
发帖数: 354 | 1 做3’RACE 快半年了，用了好几种TAQ - strategen pfu, takara, biorad bioline,
invitrogen platium hifi. 3‘引物设计了6个，条件也优化（AT,elonging time, mg+
)，要不什么也没有要不没有P出目的条带（测序后错配了）。。。唉 都要崩溃了..
另外的一个基因到是P出来了，这个基因3'端有很多重复序 GC 50-60%的样子 请教大家
一般用什么办法或强大的酶。。。
非常感谢 |
a*****n
发帖数: 2835 | 2 首先看你用的cdna来源的细胞组织有没有目的基因的表达
PCR条件可以加点DMSO，槽式PCR试试，酶可以试试clontech的advantage 2 system
mg+
【在 e****p 的大作中提到】
: 做3’RACE 快半年了，用了好几种TAQ - strategen pfu, takara, biorad bioline,
: invitrogen platium hifi. 3‘引物设计了6个，条件也优化（AT,elonging time, mg+
: )，要不什么也没有要不没有P出目的条带（测序后错配了）。。。唉 都要崩溃了..
: 另外的一个基因到是P出来了，这个基因3'端有很多重复序 GC 50-60%的样子 请教大家
: 一般用什么办法或强大的酶。。。
: 非常感谢
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r*****l
发帖数: 457 | 3 在基因组DNA里试试一端用随机引物pcr
mg+
【在 e****p 的大作中提到】
: 做3’RACE 快半年了，用了好几种TAQ - strategen pfu, takara, biorad bioline,
: invitrogen platium hifi. 3‘引物设计了6个，条件也优化（AT,elonging time, mg+
: )，要不什么也没有要不没有P出目的条带（测序后错配了）。。。唉 都要崩溃了..
: 另外的一个基因到是P出来了，这个基因3'端有很多重复序 GC 50-60%的样子 请教大家
: 一般用什么办法或强大的酶。。。
: 非常感谢
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e****p
发帖数: 354 | 4 请问如何解释啊
谢谢
【在 r*****l 的大作中提到】
: 在基因组DNA里试试一端用随机引物pcr
:
: mg+
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e****p
发帖数: 354 | 5 DSMO NESTED试了没有用，试试CLONTECH 吧虽然贵点
【在 a*****n 的大作中提到】
: 首先看你用的cdna来源的细胞组织有没有目的基因的表达
: PCR条件可以加点DMSO，槽式PCR试试，酶可以试试clontech的advantage 2 system
:
: mg+
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r*****l
发帖数: 457 | 6 是克隆未知基因么？
多年以前，我隐约记得通过3race搞不出来，我就一端用特异引物，一端用随机引物，
用tail pcr做出来的
【在 e****p 的大作中提到】
: 请问如何解释啊
: 谢谢
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R*****w
发帖数: 447 | 7 这个是行不通的，一旦引物加到反应体系里了你就没法控制引物binding到那一端？
随机引物可以做正向的也可以做反向的。
但是我有一个方法，是我以前扩增Novel病毒是想到的，而且很有效。
在做反转录时用特殊的随机引物，在随机引物的5'端加一段已知序列例如：5'-
GCTACTAGTCGATCGTnnnnnn-3'。这样你就在所有cDNA的5’端加了一个Tail。
然后做PCR时forward primer用你的5’端Gene specific引物，反向引物用这个tail“5
'-GCTACTAGTCGATCGT-3'”你就肯定能扩到3’端，可以一步一步往3’端扩。
可能ronbell想说的也是这种方法吧？
其实Race最麻烦的还是5’-race。这以前一直用一个酶在cDNA的3’端加A。但不是很有
效，有时可以扩到5’端的序列有时弄很难
【在 r*****l 的大作中提到】
: 在基因组DNA里试试一端用随机引物pcr
:
: mg+
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e****p
发帖数: 354 | 8 请问这个随机引物是自己合成的还是可以直接买到的啊？
这样的话RT后 PCR会有很多条带吧，
谢谢！
“5
【在 R*****w 的大作中提到】
: 这个是行不通的，一旦引物加到反应体系里了你就没法控制引物binding到那一端？
: 随机引物可以做正向的也可以做反向的。
: 但是我有一个方法，是我以前扩增Novel病毒是想到的，而且很有效。
: 在做反转录时用特殊的随机引物，在随机引物的5'端加一段已知序列例如：5'-
: GCTACTAGTCGATCGTnnnnnn-3'。这样你就在所有cDNA的5’端加了一个Tail。
: 然后做PCR时forward primer用你的5’端Gene specific引物，反向引物用这个tail“5
: '-GCTACTAGTCGATCGT-3'”你就肯定能扩到3’端，可以一步一步往3’端扩。
: 可能ronbell想说的也是这种方法吧？
: 其实Race最麻烦的还是5’-race。这以前一直用一个酶在cDNA的3’端加A。但不是很有
: 效，有时可以扩到5’端的序列有时弄很难
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R*****w
发帖数: 447 | 9 需要你自己设计序列，让公司合成的。这段tail序列可以是任意序列，但你需要先
blast一下，不要找个与human或mouse的genome相似性很高的，否则你会有麻烦。
理论上会有很多条带，甚至smear，但实际上只会有1－3条带，你可以只挑最大的那条
带做克隆测序就可以了。
good luck |
C*******e
发帖数: 4348 | 10 你想到的这个有个类似的方法几年前就有人发表了
用RNA Ligase加一个自己设计的adaptor（DNA)到RNA的3'端，
然后用gene specific forward primer和adaptor specific reverse primer扩增
5'RACE也可以用这个方法做
我试过这个方法的3' RACE，还蛮方便的
因为我做的原核，没有poly-A tail，没有kit可以用
这个方法帮了我大忙
“5
【在 R*****w 的大作中提到】
: 这个是行不通的，一旦引物加到反应体系里了你就没法控制引物binding到那一端？
: 随机引物可以做正向的也可以做反向的。
: 但是我有一个方法，是我以前扩增Novel病毒是想到的，而且很有效。
: 在做反转录时用特殊的随机引物，在随机引物的5'端加一段已知序列例如：5'-
: GCTACTAGTCGATCGTnnnnnn-3'。这样你就在所有cDNA的5’端加了一个Tail。
: 然后做PCR时forward primer用你的5’端Gene specific引物，反向引物用这个tail“5
: '-GCTACTAGTCGATCGT-3'”你就肯定能扩到3’端，可以一步一步往3’端扩。
: 可能ronbell想说的也是这种方法吧？
: 其实Race最麻烦的还是5’-race。这以前一直用一个酶在cDNA的3’端加A。但不是很有
: 效，有时可以扩到5’端的序列有时弄很难
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R*****w
发帖数: 447 | 11 你说的用RNA ligase我后来也见过。但直接在RT的时候加一个tail比那种合成cDNA后再加tail更方便、更有效。毕竟合成cDNA后，再加tail不是100％cDNA都会有tail。
我这个方法是我当时自己想到的，但我一直没发表，后来博士毕业了不做测序工作了，也没想过去发表。好多年了不知是否其他有人发表类似的方法，估计也会有其他人想到。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 你想到的这个有个类似的方法几年前就有人发表了
: 用RNA Ligase加一个自己设计的adaptor（DNA)到RNA的3'端，
: 然后用gene specific forward primer和adaptor specific reverse primer扩增
: 5'RACE也可以用这个方法做
: 我试过这个方法的3' RACE，还蛮方便的
: 因为我做的原核，没有poly-A tail，没有kit可以用
: 这个方法帮了我大忙
:
: “5
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R*****w
发帖数: 447 | 12 其实要做5'or3'race还有一种方法：用ligase把cNDA连成环状，然后用背对背的PCR引
物做PCR。可以同时把5'or3'序列都得到，这种方法理论上很perfect，但实际上还是不
太有效 |
p****p
发帖数: 3360 | 13 有意思。不过cDNA应该是RNA－DNA hybrid双链或者cDNA单链，应该用什么ligase？
【在 R*****w 的大作中提到】
: 其实要做5'or3'race还有一种方法：用ligase把cNDA连成环状，然后用背对背的PCR引
: 物做PCR。可以同时把5'or3'序列都得到，这种方法理论上很perfect，但实际上还是不
: 太有效
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p****p
发帖数: 3360 | 14 有意思。不过cDNA应该是RNA－DNA hybrid双链或者cDNA单链，应该用什么ligase？
【在 R*****w 的大作中提到】
: 其实要做5'or3'race还有一种方法：用ligase把cNDA连成环状，然后用背对背的PCR引
: 物做PCR。可以同时把5'or3'序列都得到，这种方法理论上很perfect，但实际上还是不
: 太有效
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C*******e
发帖数: 4348 | 15 用RNA ligase的那个不是在合成cDNA以后加tail
是mRNA直接加tail
然后再RT-PCR
再加tail
更方便、更有效。毕竟合成cDNA后，再加tail不是100％cDNA都会有tail。
，也没想过去发
表。好多年了不知是否其他有人发表类似的方法，估计也会有其他人想到。
【在 R*****w 的大作中提到】
: 你说的用RNA ligase我后来也见过。但直接在RT的时候加一个tail比那种合成cDNA后再加tail更方便、更有效。毕竟合成cDNA后，再加tail不是100％cDNA都会有tail。
: 我这个方法是我当时自己想到的，但我一直没发表，后来博士毕业了不做测序工作了，也没想过去发表。好多年了不知是否其他有人发表类似的方法，估计也会有其他人想到。
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C*******e
发帖数: 4348 | 16 RNA ligase
RNA ligase可以催化RNA-RNA，RNA-DNA的ligation
而且其催化效率比DNA ligase高多了
可以说DNA ligase真是一个很烂的酶啊
【在 p****p 的大作中提到】
: 有意思。不过cDNA应该是RNA－DNA hybrid双链或者cDNA单链，应该用什么ligase？
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