h*****d
发帖数: 210 | 1 EMSA 新手，求教高手以下问题。
我从种子提nuclear extract, 想做EMSA, 用的是DIG-Gel shift kit. 开啥有了
TATABOX （5 repeats) 25bp in length, 试试看蛋白是不是有功能的，结果没加蛋白
的free probe也有带，所以认为我那加了蛋白后产生的带不是真的binding，因为2 带
的位置是一样的。但是有些情况用其他大一点的探针，50bp, 会得到smear. 还有我跑
电泳的胶很小，8x8cm（bio-rad)， 5% native gel. 0.25x TBE buffer, 4C, 80V.
问题：
1）怎么能证明蛋白是用功能的？现在没有binding， 不知是不是蛋白的原因，SDS-
PAGE 检测蛋白还行。抽的几次都是结果差不多，尽管有些带很强且集中在2个区段，但
总体来讲，蛋白的分布大小都有。
2)能不能找个其他probe 做postitive control。 有人可以推见一下啥探针？
3）我是用的nuclear extract, 探针可不可以用200bp 长的。
4)调整些啥才能有好的bindin | a*****i
发帖数: 361 | 2 我最近在做EMSA,也还是处于摸索阶段。
但是对于probe 200bp应该是可以的，我用的是400bp，因为我不太确定具体的binding
位点。另外，如果probe的条带和加蛋白以后一样只能说明没有bind的吧。我刚开始也
一直找不到binding的条带，后来配了几种不同的buffer，发现有一种效果好一点。这
个binding reaction的条件可能需要自己试一下，怎么样最合适。我用的是RNA，操作
过程中很容易降解，所以到现在也没一张我老板满意的picture。
希望你试验一切顺利！ | a****o
发帖数: 1786 | 3 如果加抗体产生supershift， 可以证明是特异结合,用extract产生 smear, 太正常了
，你可能需要稍微纯化以下，同位素要灵敏的多，每次做实验只需要很少的量，就是标
记是量大些，试试加点镁离子， tRNA, polydI-dG | h*****d
发帖数: 210 | 4 加蛋白probe是不一样的， it is smear, but there is not a single distinct
probe. Could have some reasons for this, first of all, probe denaturing and
annealing is not good, I bought oligonucleotide, because it is highly
purified. the free probe is also smear which is about half length of the
smear with protein.
secondly, when I extract nuclear protein, I just use 250M sucrose in the
extraction buffer for nuclei and no further gradient centrifuge thereafter.
High/low salt method for getting nuclear protein(
【在 a*****i 的大作中提到】
: 我最近在做EMSA,也还是处于摸索阶段。
: 但是对于probe 200bp应该是可以的，我用的是400bp，因为我不太确定具体的binding
: 位点。另外，如果probe的条带和加蛋白以后一样只能说明没有bind的吧。我刚开始也
: 一直找不到binding的条带，后来配了几种不同的buffer，发现有一种效果好一点。这
: 个binding reaction的条件可能需要自己试一下，怎么样最合适。我用的是RNA，操作
: 过程中很容易降解，所以到现在也没一张我老板满意的picture。
: 希望你试验一切顺利！
| h*****d
发帖数: 210 | 5 关键是smear是不是说明蛋白是好的，只是binding 条件不好呢？可能正如你说的，蛋
白不是很纯。用的是POLY DI-DC。也用了poly-lysine, 说是可以促进binding.但没有
效果。
【在 a****o 的大作中提到】
: 如果加抗体产生supershift， 可以证明是特异结合,用extract产生 smear, 太正常了
: ，你可能需要稍微纯化以下，同位素要灵敏的多，每次做实验只需要很少的量，就是标
: 记是量大些，试试加点镁离子， tRNA, polydI-dG
| l*******k
发帖数: 361 | 6 EDTA有些时候对binding会有很不好的影响，尤其是你的蛋白是ATP binding protein的
话，你可以用Tris-Boric Acid buffer试试，合适的binding condition（buffer, ph...)需要自己摸索的，我觉得你可以找一个TATA binding protein作为positive control来改进你的实验条件，一般来说，probe越长binding越难检测， 100bp左右比较reasonable，200bp有些太长了 | h*****d
发帖数: 210 | 7 我试过了TATABOX1 有5个重复，共25bp (5x5)不过效果不好，不知为啥。
只不过这个探针不是我标记的，也很长时间了，大约有 一年多了。free probe 有个带
可能是跑的时间不长吧。
ph...)需要自己摸索的，我觉得你可以找一个TATA binding protein作为positive
control来改进你的实验条件，一般来说，probe越长binding越难检测， 100bp左右比
较reasonable，200bp有些太长了
【在 l*******k 的大作中提到】
: EDTA有些时候对binding会有很不好的影响，尤其是你的蛋白是ATP binding protein的
: 话，你可以用Tris-Boric Acid buffer试试，合适的binding condition（buffer, ph...)需要自己摸索的，我觉得你可以找一个TATA binding protein作为positive control来改进你的实验条件，一般来说，probe越长binding越难检测， 100bp左右比较reasonable，200bp有些太长了
| l*******k
发帖数: 361 | 8 25bp的probe很容易dissociate,我用过39bp的，fresh made都有single strand band,
两个星期以上的就不会再用了，重新做新的，你竟然用一年的，pfpf | h*****d
发帖数: 210 | 9 我前2天查过啦，发现一半是single strand band.25bp probe 不是我的，借比人用的
，她半年
前用过，还可以。不过你说的是对的，用FRESH的probe比较好。
【在 l*******k 的大作中提到】
: 25bp的probe很容易dissociate,我用过39bp的，fresh made都有single strand band,
: 两个星期以上的就不会再用了，重新做新的，你竟然用一年的，pfpf
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