f*******d
发帖数: 92 | 1 小妹刚刚开始做NfkB pathway.
想研究一个treatment对细胞能不能激活这个pathway。我首先做了IkBa western, 看到
了降解。然后做了EMSA. 也看到了increased gel shift. EMSA用的probe是买的biotin
labeled, 序列如下：AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC。
然后我想看看不同的基因超表达会不会对这个造成影响，所以就在细胞系里面建立了
luciferase reporter system. 用的是买来的plasmid, pGL4.32. 作实验的时候，用
TNFa做了positive control, 看到了大概10倍的信号。但是这个时候，我的treatment
确一点信号扩增都没有。 我后来查了一下pGL4.32厘米的nfkb reponse element, 发现
DNA序列跟之前我做EMSA的序列不一样，是GGGAATTTCC GGGGACTTTCCGGGAATTCC
GGGGACTTTCCGGGAATTTCC。 我就不知道该怎么办了。为什么同样的Nfkb，大家用 EMSA
DNA 序列会跟这个r... 阅读全帖 |
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d****7
发帖数: 109 | 2 如sunnyday所说，加点control试试
EMSA里的学问还是挺大的，你得做做optimisation，否则结果不会好看的。
首先，你用的是nuclear extract还是纯化的蛋白？纯化的蛋白要比nuclear extract好
很多，不过如果你的蛋白不是transcription factor的话，也只能用nuclear extract
了，细节可以看看研究转录的圣经《Transcriptional Regulation in Eukaryotes:
Concepts, Strategies, and Techniqes: Concepts, Strategies and Techniques》
盐浓度也很重要，很多蛋白－DNA都是salt dependent，而且不同蛋白需要的optimal盐
浓度不一样，比如SRF我们用150 mM盐，但是150mM盐做Forkhead的话，基本上都是非常
弱的binding，调到75 mM正好适合Forkhead。所以需要做个salt titration.
另外non-specific DNA的选择也非常重要，不同的non-speci... 阅读全帖 |
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h*****d
发帖数: 210 | 3 EMSA 新手，希望能碰到生物学的老师帮我看看。
我从种子提nuclear extract, 想做EMSA, 用的是DIG-Gel shift kit. 开啥有了
TATABOX （5 repeats) 25bp in length, 试试看蛋白是不是有功能的，结果没加蛋白
的free probe也有带，所以认为我那加了蛋白后产生的带不是真的binding，因为2 带
的位置是一样的。但是有些情况用其他大一点的探针，50bp, 会得到smear. 还有我跑
电泳的胶很小，8x8cm（bio-rad)， 5% native gel. 0.25x TBE buffer, 4C, 80V.
问题：
1）怎么能证明蛋白是用功能的？现在没有binding， 不知是不是蛋白的原因，SDS-
PAGE 检测蛋白还行。抽的几次都是结果差不多，尽管有些带很强且集中在2个区段，但
总体来讲，蛋白的分布大小都有。
2)能不能找个其他probe 做postitive control。 有人可以推见一下啥探针？
3）我是用的nuclear extract, 探针可不可以用200bp 长的。
4)调整些啥才能有好 |
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h*****d
发帖数: 210 | 4 EMSA 新手，求教高手以下问题。
我从种子提nuclear extract, 想做EMSA, 用的是DIG-Gel shift kit. 开啥有了
TATABOX （5 repeats) 25bp in length, 试试看蛋白是不是有功能的，结果没加蛋白
的free probe也有带，所以认为我那加了蛋白后产生的带不是真的binding，因为2 带
的位置是一样的。但是有些情况用其他大一点的探针，50bp, 会得到smear. 还有我跑
电泳的胶很小，8x8cm（bio-rad)， 5% native gel. 0.25x TBE buffer, 4C, 80V.
问题：
1）怎么能证明蛋白是用功能的？现在没有binding， 不知是不是蛋白的原因，SDS-
PAGE 检测蛋白还行。抽的几次都是结果差不多，尽管有些带很强且集中在2个区段，但
总体来讲，蛋白的分布大小都有。
2)能不能找个其他probe 做postitive control。 有人可以推见一下啥探针？
3）我是用的nuclear extract, 探针可不可以用200bp 长的。
4)调整些啥才能有好的bindin |
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g*******0
发帖数: 2152 | 5 我做 EMSA 都是用4% 或6% PAGE (arc:bis 1:19)。如果蛋白加多了，即使是蛋白分子
不大，radioactive 也会都留在孔里。没买过 gradient gel 做 EMSA,是不是得注意
buffer system? |
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H*g
发帖数: 2333 | 6 准备用纯化的his-tag蛋白做EMSA，不知道imidazole会不会对EMSA有很大影响。
请教大家，需要事先脱盐除掉imidazole(300mM)吗？不知道要不要老板去买desalting
的柱子。
Thanks！ |
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a********n
发帖数: 844 | 7 建议拿到蛋白后直接做个EMSA试一试能不能。dialysis几步下来蛋白损失，活性可能受
影响，如果EMSA不被imidazole影响，就可以省去dialysis这个麻烦。 |
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a********n
发帖数: 844 | 8 所以说不要胶纯化radioactive RNA,创造太多机会污染实验室了。我们几年来就在实验
室里边一个公用实验台做radioactive的东西，没有发生污染，连专用的高速离心机都
不需要，就需要一个小小的甩甩管壁上的东西。filter binding的前提是EMSA没问题，
有特意的带，你得把EMSA做出正常的结果才行。 |
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d*********e
发帖数: 18 | 9 通过gel shift assay (EMSA)计算了蛋白跟一系列底物的结合常数kd.
但是审稿人说：EMSA measurements are non-equilibrium and do not yield Kd
values.
请教应该如何回应？
有些文献用表观解离常数kapp来替代kd，这个是否正确？
谢谢。 |
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I*****y
发帖数: 6402 | 10 EMSA还用啥kit啊？ 我以前的那个实验室都是自己做probe，做那种很长的胶
to |
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T**********t
发帖数: 1604 | 11 EMSA就是gel shift么？
原来还有kit可以用啊。 |
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a*****i
发帖数: 361 | 12 有人做EMSA? 可不可以提供一个RNA和蛋白质binding buffer的配方?
我刚开始做，看到网上有一些是用来做DNA和蛋白质的，是不是也可以用来做RNA?
谢谢了！ |
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a*****i
发帖数: 361 | 13 我最近在做EMSA,也还是处于摸索阶段。
但是对于probe 200bp应该是可以的，我用的是400bp，因为我不太确定具体的binding
位点。另外，如果probe的条带和加蛋白以后一样只能说明没有bind的吧。我刚开始也
一直找不到binding的条带，后来配了几种不同的buffer，发现有一种效果好一点。这
个binding reaction的条件可能需要自己试一下，怎么样最合适。我用的是RNA，操作
过程中很容易降解，所以到现在也没一张我老板满意的picture。
希望你试验一切顺利！ |
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x**y
发帖数: 46 | 14 跟我最近的EMSA相似，给你一些有用的意见：
1. 如果你的蛋白有aggregation，加一些Triton100(0.1，0.5or1%). 听很多人说，这
很有用。
2. 用4-12% TBE gel （Invitrogen）。如果自己配，用4%。或者3%，下层加三分之一
15%防止free probe run out。
3. 如果还不行，用垂直配胶系统（Bio-rad配PAGE gel用的， 1.5mM）配Agrose胶（1%
？ 2%？记不清了）。里面可以加Triton & glycerol。
我的蛋白80kD， oligomerization 后500 or 1000kD （FPLC测定）。6%TBE gel完全在
well上，4-12%能进一点点，3%可完全进入但很难看。最近我们lab新来的Postdoc用了
Agrose胶，效果不错。我让他加了一些Triton & glycerol，效果更好了，binding
affinity 都增加了几倍。但具体浓度，我得问问他。 |
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j***a
发帖数: 2 | 15 这里EMSA 高手很多，请大家帮忙看看
用一段PROMOTER 序列（200bp) 做probe, 能binding 到体外转录的蛋白上，但背景比
较高然后用两个片段来做probe, 有一段能binding, 。奇怪的是，当把这个片段再弄成
两段（直接合成PRIMER, ANNEAL)就没有binding了，难道是这个binding 需要二级结构
？ |
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S****2
发帖数: 164 | 16 1) non radioactive的EMSA kit发现pierce有卖，但文章很少，不知道能用不？
2) Chromatin IP，每次的sonication结果都不太一样，有时候200-1000 bp，有时候
1000 bp-genome size的smear
1% SDS根据millipore的EZ-ChIP自己配的
misonix 3000 with cuphorn adaptor
program： 10s On, 5s off, 30 cycles, 300ul sample volume, tube placed in
chilled water (if on wet ice，sds recipitates everytime within 1 minute)
谢先！ |
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w******e
发帖数: 1187 | 17 前段时间来求救，做EMSA，连作为negative control的library都bind的一塌糊涂：
http://www.mitbbs.com/article0/Biology/31394721_0.html
得到了大家的很多宝贵建议。综合考虑后觉得自己的protein是形成了aggregate，拖了
n久总算确认
了——见附件图。gel 是4% native PAGE，silver stain，lane 1/2/4是target
protein，
3/5是control（5是homolog，如果没aggregate的话target也该在那个position）。其
中lane
2/4加了0.1%/1%的triton，没区别。另外也试了DTT，也不行。真衰呀。。。
这个target是我side project必须要用的，而且要用大量。好不容易找到家便宜的，还
这么背。。
。还有什么方法可以搞掉这个aggregate吗？更狠的detergent？？请指教！//bow |
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b**y
发帖数: 86 | 18 最近刚开始做EMSA，我用的是Pierce的Lightshift kit. 多次实验都只看到
nonspecifec binding（不能被unlabeled oligo竞争掉）。我发现一个原因可能是
binding reaction里盐浓度过高，因为kit提供的binding buffer（10*）含有500mM
KCl,而我的nuclear extract最后是由high salt buffer提取的，F.C.225mM NaCl。于
是我省略了binding buffer，把最后的NaCl浓度调整在50-75mM，得到了一条specific
的binding，但是非常弱。
问题1. 我看到的paper和protocol都使有类似的binding buffer，而且也用类似方法提
取核蛋白，好像并不考虑nuclear extract里的盐浓度，事实上这个浓度很高。但是，
我的几个sample extract蛋白浓度不同，加入同样多的蛋白的话最终盐浓度就会不同。
大家怎么解决这个问题？透析又怕蛋白容易降解。
问题2. 我加入的nuclear extract的体积无法忽略，大概有10u... 阅读全帖 |
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B****N
发帖数: 18 | 19 透析一下试试。我的蛋白量也很少，EMSA根本不行。后来透析了就work了。 |
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I*****y
发帖数: 6402 | 20 在我以前用过的系统里面，300 mM imidazole影响EMSA的binding, oligomerization
desalting |
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H*g
发帖数: 2333 | 21 你准备做EMSA的蛋白是从E.coli纯化表达的吗，带什么tag不 (GST, 6xHis, etc)， 还
是用in vitro transcription/translation得到的？ |
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a********n
发帖数: 844 | 22 如果lz在讲附上的胶，我的看法是：
1.上面那个带是well里边滞留的，下面那个是free CTP还是free RNA不好说。但整个胶
曝光时间不够长。我做过无数EMSA，也是RNA aptamer，RNA 从MAXIscript得到后不用
纯化，直接取1 ul去跑denaturing gel，看看有没有transcripts，产量有可能因为变
化的，所以每批都要检验。我组里有个博后不信邪，在这上面浪费了几个星期，一直以
为是这个那个仪器不好用。
2.lz提到protine minus也有多条带，这在native gel里边太正常了，因为RNA有多种
folding的可能性，即使mfold只给出一种结构，我在胶里也能看到很多条带。蛋白特异
性的带可能跟RNA一下带superimpose，但是你会看到下边一条带变弱，上面一条带变强
，这样你要换种浓度的胶跑跑。
3.制胶和电泳液可以用1/4xTBE或者1/2xTGB，前者我用的比较多，这个每个蛋白性质有
关，一般都要试试。
4.ARGA胶有些时候可以替代page，想B52的RNA APTAMER只能在ARGA胶才能看到shift，
原因不... 阅读全帖 |
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w******e
发帖数: 1187 | 23 update一下，根据版上几位铜锈的意见换了buffer，果然以前probe都没有入胶（
still don't know why though, as I use 1XTBE all the time)，然后很ft的
发现protein target要加到上百nM才能看到shift，然后成linear上升-_-
最后换了SPR，结果跟filter binding一致，low nM Kd。但是EMSA为什么没
work还是不清楚，急着wrap up project也就没多试其他buffer/gel system |
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S*********s
发帖数: 304 | 24 我觉得你luciferase assay有问题。
一般TNF刺激, NF-KB luc reporter应该有100 fold左右的差别。
According to 某免疫大牛，<10 fold的他们认为太trivial
可以QPCR做几个下游的基因看看
另外如果真的觉得有变化，不妨做RNASeq or array.
biotin
treatment
EMSA |
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S*********s
发帖数: 304 | 25 看看 David Baltimore的paper
biotin
treatment
EMSA |
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c******a
发帖数: 267 | 26 是的，做过的估计都会觉得10倍的增加太少了，尤其是用tnf刺激的。当然我不知道你
处理多长时间以后测的luciferase activity.
qPCR随便做几个well-characterized 下游基因就好了，比如TNFa, IL6, IkBa, IL8之
类的
另外，IkBa Western 和EMSA的结果都要比luciferase assay更可靠吧。 |
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f*******d
发帖数: 92 | 29 多谢！那为啥做EMSA的序列和做luciferase reporter的序列不一样呢～ |
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f*****e
发帖数: 223 | 30 用的是Pierce LightShift® Chemiluminescent EMSA Kit, 电泳用Biorad TBE
precast Gel。 按照说明书改变过glycerol和 NP40的量，但总没有shift 和
supershift的条带。探针区域ChIP结果阳性。 请教有啥高招啊 |
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Z******5
发帖数: 435 | 31 楼主做的啥实验啊？ 现在很多实验都可以用化学发光代替了。
我最近做EMSA用的是pierce家的kit，信号非常好。
说个小小的经验，这个EMSA带的ECL最好不要用在Western中，太强，压片出来经常一片
糊。 |
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d*******s
发帖数: 61 | 32 看过该网站回复人的帖子后，发现原来造假问题是异常严重的：WB里面，GAPDH的一张
图片被反复用在多个图中；而且在他们后来发表的其它 8 篇论文中，还存在相同的问
题！这是很明显的蓄意作假了。这些论文在下面用黑体标明：
7 Responses:
Well that was easy….In the v282#17p12363 paper, look at the GAPDH bands in
Figure 3A. Now go back to Figure 2C and look at the GAPDH bands. Lanes 4-5-6
are the same. They duplicated the blot.In the v283#29p20045 paper, Fig 3A
right panel GAPDH blot contains the same 2 bands as Fig. 5D.So, the “
mistake” appears to involve using the same GAPDH blot for different
experiments. ... 阅读全帖 |
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e*****t
发帖数: 110 | 33 小女国内一流大学毕业，有医学、生物背景，但是不能考版。10年+bench work经验，
掌握的技术很多。分子生物，细胞，细菌，慢病毒，小鼠大鼠动物模型，FACs，ELISA
，qpcr，免疫荧光染色、组化、WB，IP，coIP，EMSA,RIA等等。因第一个老板做的方向
不是很对口，磨绿卡没换地方，现在对做PI没了信心和资历，因lg要来boston读书，想
找个技术员的职位。
本人工作效率比较高，不喜欢没事在实验室耗（家有上学的小孩，也耗不起）。现在的
工作量差不多平均每天能跑6-8张WB外加其他实验。不需VISA，有绿卡
有兴趣的请站内联系，我可以给你发CV和ref。 |
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C*********m
发帖数: 213 | 34 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: CrystalAtom (水晶阿土木), 信区: Biology
标 题: 这里有做CHIP-Seq的兄弟么
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Jun 1 14:40:31 2015, 美东)
我有个蛋白，平时都在核外，某个条件下跑到核内成为（疑似）转录因子。有两个组以
前做过转录活性，但是文章比较老了。我们自己也做过EMSA，看到和DNA的结合，也有
核内核外成像定位的数据。但关键是不能确定是否真的是转录因子。现在的数据也就够
个JBC之流的杂志。和两个实验室试图合作做Chip-Seq，但是对方都不卖力，迄今没有
进展，很失望。请问版上有哪位大哥大姐可以做这方面的实验，短期内能出一些数据，
可以合作写文章。
有兴趣的请私信联系。 |
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g*****u
发帖数: 14294 | 37 这下可以了吧：
ACI
ACOR
ADS
AGG
AGZ
AHD
AMSC
ANN
ASIA
BSFT
BWEN
CHC
CHK
CHS
CLR
CMF
CMG
CNW
CNX
COG
CPST
CRK
CRMD
DCTH
DENN
DG
DLR
DQ
ECA
ELON
EMSA
ES
EXAS
FAZ
FTR
FXF
FXY
GBF
GLNG
GLUU
GME
GSS
GVI
HGG
HYC
ICO
IEF
IEI
IGOV
INCY
INN
JRCC
KEM
LD
LULU
MFN
MLN
MUB
MXA
MY
NTAP
NVGN
NWBI
NYF
ODFL
PAY
PLCM
POT
PPO
PWAV
RBCN
RRC
SDS
SH
STND
SUB
SWN
TLH
TLT
UCBI
UHS
UUP
VHC
VR
VRD
WFMI
WNR
WPRT
YONG |
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e*****t
发帖数: 110 | 38 小女国内一流大学毕业，有医学、生物背景，但是不能考版。10年+bench work经验，
掌握的技术很多。分子生物，细胞，细菌，慢病毒，小鼠大鼠动物模型，FACs，ELISA
，qpcr，免疫荧光染色、组化、WB，IP，coIP，EMSA,RIA等等。因第一个老板做的方向
不是很对口，磨绿卡没换地方，现在对做PI没了信心和资历，因lg要来boston读书，想
找个技术员的职位。
本人工作效率比较高，不喜欢没事在实验室耗（家有上学的小孩，也耗不起）。现在的
工作量差不多平均每天能跑6-8张WB外加其他实验。不需VISA，有绿卡
希望老板不要太变态就行了，reasonable pushy一点没关系。
请有相关信息的bostoners站内短我，比如知道哪个老板想招人啥的，多谢！ |
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r****o
发帖数: 105 | 39 本文献给YL
（十五）AP1的活性测定
第二个模块的实验，DNA affinity chromatography之后我们又跑了一个更精细的
Gel filtration，用的是Amersham卖的Superose 6预装柱子。纯化步骤就只有这么多了。
剩下的就是一些活性测定。无论是sephacryl分出来的组分还是DNA affinity column分出
来的组分，我们都测试了AP-1的活性。方法呢就只有两种，一种是凝胶迁移率变动分析
(EMSA)，另一种是DNA水解酶I 足迹分析 (DNase I footprinting assay)，都可以用来分析
蛋白与特定DNA的结合能力。我过去没做过这两种实验，所以感觉很新奇，做的也格外卖
力，结果也还不错。
Gel Mobility-shift assay 原理很简单，把蛋白质样品和P32标记的寡聚核苷酸探针
一起孵育十几分钟, 然后拿去跑一个低浓度acrylamide胶。如果探针结合上蛋白了，速度
会变慢很多，就会停滞在胶的上段；如果没有结合上，探针就会自由的跑到胶的下段去。
然后把胶拿去做放射自显影就行了。跑胶的装置 |
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D****g
发帖数: 275 | 40 读Paper的时候发现，人们常用Drasophila的细胞共表达转录因子和Promoter Reporter
质粒去检测转录因子对Promoter的作用，我不明白为什么不用Mammalian细胞而是用昆
虫细胞哪？
另一个问题是文章中常用COS细胞表达转录因子，然后提取核蛋白，EMSA检测该蛋白与
Promoter序列的结合，不明白人们为什么倾向于COS细胞而不是别的细胞例如HEK293?
有没有人知道？ |
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l*****a
发帖数: 1431 | 41 第二个问题：做EMSA选细胞要选没有内源蛋白会和promoter结合的细胞。 |
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h**********8
发帖数: 650 | 44 Peirce
Actually, if you can bio label or p32 label by yourself, there is no need to
buy such expensive kit.
For biotin labeled, 1 percent SDS can be used for blocking and washing. |
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a*****i
发帖数: 361 | 45 Nature Protocols 2, 1849 - 1861 (2007)
Published online: 26 July 2007 | doi:10.1038/nprot.2007.249
Title: Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein–
nucleic acid interactions
Authors: Lance M Hellman1 & Michael G Fried1
email: l********[email protected] |
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s******r
发帖数: 2876 | 46 http://www.sendspace.com/file/idzaa0
Nature Protocols 2, 1849 - 1861 (2007)
Published online: 26 July 2007 | doi:10.1038/nprot.2007.249
Title: Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein–
nucleic acid interactions
Authors: Lance M Hellman1 & Michael G Fried1
email: l********[email protected] |
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a*****i
发帖数: 361 | 47 我想要非同位素来标记RNA,然后要用EMSA来检测RNA protein interaction.
在网上找了一些，但不知道有没有人做过这方面的，有那家公司的kit比较方便好用？
非同位素标记看到最多的就是生物素，还有别的？
谢谢！ |
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a***e
发帖数: 1010 | 49 those buffers are quite similar.
maybe you need some tRNA to reduce unspecific binding. |
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