h********n
发帖数: 4079 | 1 请教各位高人一个问题: conditional KO (LoxP) mice + Cre mice杂交产生KO mice
的时候,哪个是男/女有关系吗? 我好像有个印象, 应该要female Cre mice, 但不确定.
还有一个问题是, Cre对老鼠有其它影响吗?
哪位高人说说? 谢谢谢谢. |
D*a
发帖数: 6830 | 2 我们用的是Cre male，因为有的cre female在生殖细胞里面有早期表达，后代就都成
total KO了。 |
D*a
发帖数: 6830 | 3 cre对老鼠有影响的是它插入的位点，如果恰好是关键基因，就造成老鼠mutation了，
或者正好插入你想引入的基因附近，那么你就基本上别想拿到你想要的老鼠了。 |
w****8
发帖数: 36 | |
h********n
发帖数: 4079 | 5 谢谢.
【在 D*a 的大作中提到】
: cre对老鼠有影响的是它插入的位点，如果恰好是关键基因，就造成老鼠mutation了，
: 或者正好插入你想引入的基因附近，那么你就基本上别想拿到你想要的老鼠了。
|
s******e
发帖数: 370 | 6 看是什么promoter的cre
我碰上过一个EIIa－cre，发现用cre的公鼠经常出现partial KO，查了资料发现这个
promoter在oocyte里最活跃，受精后保持短暂活跃。于是换成cre的母鼠，效果就好多
了。 |
D*a
发帖数: 6830 | 7 没说反么? EIIa Cre 的母鼠才应该是total KO才对么？公的EIIa－cre后代是mosaic的
正在做这个。
ps 跟lz说，不光是EIIa Cre这种已知的造成后代mosaic的会这样，我现在用的一个
camk promoter 的公的，后代也时不时出来几只 total KO，所以一般新老鼠，你要把
脑心肝肾皮肤什么的都做一遍pcr，还有dynamic的KO时间，来确定它是不是specific
的，和KO时间是不是和你想要的一致。
【在 s******e 的大作中提到】
: 看是什么promoter的cre
: 我碰上过一个EIIa－cre，发现用cre的公鼠经常出现partial KO，查了资料发现这个
: promoter在oocyte里最活跃，受精后保持短暂活跃。于是换成cre的母鼠，效果就好多
: 了。
|
s******e
发帖数: 370 | 8 就是说cre由卵子提供要保险一点，因为受精的时候卵子里已经有active cre了，这样
进去的精子的chromosomes立刻可以被process。如果是在精子里的话，它还需要时间
transcribe
不过不管怎样F1出来以后还都得再筛一次，选完全的KO去establish line |
h********n
发帖数: 4079 | 9 谢谢.
【在 s******e 的大作中提到】
: 就是说cre由卵子提供要保险一点，因为受精的时候卵子里已经有active cre了，这样
: 进去的精子的chromosomes立刻可以被process。如果是在精子里的话，它还需要时间
: transcribe
: 不过不管怎样F1出来以后还都得再筛一次，选完全的KO去establish line
|
h********n
发帖数: 4079 | 10 谢谢.
【在 s******e 的大作中提到】
: 看是什么promoter的cre
: 我碰上过一个EIIa－cre，发现用cre的公鼠经常出现partial KO，查了资料发现这个
: promoter在oocyte里最活跃，受精后保持短暂活跃。于是换成cre的母鼠，效果就好多
: 了。
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h********n
发帖数: 4079 | 11 谢谢上面各位的意见.
我要用beta-actin-Cre mice, 准备用female Cre mice (homo) 和 LoxP geen A (homo
)杂交, 生下来的小老鼠挑出完全应该是 Cre+/- A+/-, 然后兄弟姐妹交配, 看A-/-的
胚胎发育的情况. 已知A-/-胚胎致死.
现在的问题是, 在比较A-/- 和 A +/+ 胚胎的时候, 我能不能把不同的Cre genotype合
并比较?
谢谢. |
D*a
发帖数: 6830 | 12 我们用的cre是postnatal的和组织specific的，所以卵子绝对不能有cre蛋白，如果有
就不是想要的KO了。
如果要从卵子就KO，可以直接用＋/- x ＋/- ,这样的话第一代随便找一个泛表达的
cre 就行了，公的母的都无所谓
也不知道lz要的是哪种，参考一下
【在 s******e 的大作中提到】
: 就是说cre由卵子提供要保险一点，因为受精的时候卵子里已经有active cre了，这样
: 进去的精子的chromosomes立刻可以被process。如果是在精子里的话，它还需要时间
: transcribe
: 不过不管怎样F1出来以后还都得再筛一次，选完全的KO去establish line
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D*a
发帖数: 6830 | 13 你这种情况最好挑第一代的Cre -/- A+/-，
然后第二代用A+/- x A+/-，以后实验和保持老鼠line也通通是这样，这样比较的时
候没有父母的影响，而且你一次性有control A +/+， knockdown A+/- 和 KO A-/-
， 多出来的A+/- 正好用来生下一批。
F2 不要把cre带进去，带进去了说不定有cre插入位点的影响，这个你还没法证明，你
自己分析结果也不放心，以后reviewer也很可能揪住这个不放。
homo
【在 h********n 的大作中提到】
: 谢谢上面各位的意见.
: 我要用beta-actin-Cre mice, 准备用female Cre mice (homo) 和 LoxP geen A (homo
: )杂交, 生下来的小老鼠挑出完全应该是 Cre+/- A+/-, 然后兄弟姐妹交配, 看A-/-的
: 胚胎发育的情况. 已知A-/-胚胎致死.
: 现在的问题是, 在比较A-/- 和 A +/+ 胚胎的时候, 我能不能把不同的Cre genotype合
: 并比较?
: 谢谢.
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h********n
发帖数: 4079 | 14 谢谢.
我也觉得带着Cre不放心, 怕reviewer以后揪住不放. 不过我可能只有两代老鼠,
第一代就是分别homo, 第二代A+/- Cre +/-, 然后准备在胚胎里面直接比较, 虽然概率
低一点, 但比较快.
【在 D*a 的大作中提到】
: 你这种情况最好挑第一代的Cre -/- A+/-，
: 然后第二代用A+/- x A+/-，以后实验和保持老鼠line也通通是这样，这样比较的时
: 候没有父母的影响，而且你一次性有control A +/+， knockdown A+/- 和 KO A-/-
: ， 多出来的A+/- 正好用来生下一批。
: F2 不要把cre带进去，带进去了说不定有cre插入位点的影响，这个你还没法证明，你
: 自己分析结果也不放心，以后reviewer也很可能揪住这个不放。
:
: homo
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D*a
发帖数: 6830 | 15 你这个是个完整的project还是什么？
实验不会这么快的，你可以从cre就开始实验你的protocol, hypothesis什么的，这个
不需要等。不过等你打算出paper的时候，你的老鼠早十代八代的了
【在 h********n 的大作中提到】
: 谢谢.
: 我也觉得带着Cre不放心, 怕reviewer以后揪住不放. 不过我可能只有两代老鼠,
: 第一代就是分别homo, 第二代A+/- Cre +/-, 然后准备在胚胎里面直接比较, 虽然概率
: 低一点, 但比较快.
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h********n
发帖数: 4079 | 16 我这个project就是想看看为啥A KO会使胚胎死掉, 老板想看看, 其实我兴趣不大. 因
为我们主要是做cancer, 这个只是side project.
【在 D*a 的大作中提到】
: 你这个是个完整的project还是什么？
: 实验不会这么快的，你可以从cre就开始实验你的protocol, hypothesis什么的，这个
: 不需要等。不过等你打算出paper的时候，你的老鼠早十代八代的了
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D*a
发帖数: 6830 | 17 为啥会死。。。这个很容易搞大阿。。。
那就先做吧，顺便也准备着搞大的cre -/-, 反正就是个pcr，否则老板想搞大的时候你
就不好交差了。。。
【在 h********n 的大作中提到】
: 我这个project就是想看看为啥A KO会使胚胎死掉, 老板想看看, 其实我兴趣不大. 因
: 为我们主要是做cancer, 这个只是side project.
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h********n
发帖数: 4079 | 18 我做的这个基因是tumor suppressor and/or metastasis suppressor, 这个才是我做
的方向, 有好多老鼠的活要做.
embryonic lethal这种事有点难, 主要是我没啥development的经验. 先干着吧. 我本
来跟老板说我不想lead这个project, 现在估计只有我能lead, 除非老板再招一个人干
活, 我就可以把这个脱手了.
上个月刚刚写了一个新的关于cancer的animal protocol(实验室以前没有独立的animal
protocol), 还好以前phd的时候写过不少类似的. 现在又写一个development的
protocol, 这两个月都在写东西. 老板坚决不肯在animal protocol上出现他老人家的
名字, 所以这两个animal protocol的PI是我, 有啥事都是我的责任啊....
【在 D*a 的大作中提到】
: 为啥会死。。。这个很容易搞大阿。。。
: 那就先做吧，顺便也准备着搞大的cre -/-, 反正就是个pcr，否则老板想搞大的时候你
: 就不好交差了。。。
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s******r
发帖数: 2876 | 19 搭车问一声，这个tumor suppressor 和 metastasis suppressor怎么区别？
如果已经抑制tumor growth了，甚至导致tumor shrink了，tumor cell数目已经减少了
，那可转移的tumor cell也少了，不是也会导致metastasis减少了吗？
我做的这个基因是tumor suppressor and/or metastasis suppressor, 这个才是我做
的方向, 有好多老鼠的活要做.
embryonic lethal这种事有点难, 主要是我没啥development的经验. 先干着吧. 我本
来跟老板说我不想lead这个project, 现在估计只有我能lead, 除非老板再招一个人干
活, 我就可以把这个脱手了.
上个月刚刚写了一个新的关于cancer的animal protocol(实验室以前没有独立的animal
protocol), 还好以前phd的时候写过不少类似的. 现在又写一个development的
protocol, 这两个月都在写东西. 老板坚决不肯在animal protocol上出现他老
【在 h********n 的大作中提到】
: 我做的这个基因是tumor suppressor and/or metastasis suppressor, 这个才是我做
: 的方向, 有好多老鼠的活要做.
: embryonic lethal这种事有点难, 主要是我没啥development的经验. 先干着吧. 我本
: 来跟老板说我不想lead这个project, 现在估计只有我能lead, 除非老板再招一个人干
: 活, 我就可以把这个脱手了.
: 上个月刚刚写了一个新的关于cancer的animal protocol(实验室以前没有独立的animal
: protocol), 还好以前phd的时候写过不少类似的. 现在又写一个development的
: protocol, 这两个月都在写东西. 老板坚决不肯在animal protocol上出现他老人家的
: 名字, 所以这两个animal protocol的PI是我, 有啥事都是我的责任啊....
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h********n
发帖数: 4079 | 20 要有单独的实验证明. 比如在细胞上做knockdown or overexpress, 但后打到老鼠尾
巴静脉看哥哥器官的cancer.
不过总体来说, metastasis suppressor 比较难确认, 因为in vivo的实验是必须的,
而且实验方法不太多. 所以你看看文献里面metastasis suppressor确认的数目不多.
有几篇review讲了这个问题, 我现在找不到, 你自己查查吧.
如果是rumor suppressor and metastasis suppressor, 实验会有些难度, 我也不太有
经验.
animal
【在 s******r 的大作中提到】
: 搭车问一声，这个tumor suppressor 和 metastasis suppressor怎么区别？
: 如果已经抑制tumor growth了，甚至导致tumor shrink了，tumor cell数目已经减少了
: ，那可转移的tumor cell也少了，不是也会导致metastasis减少了吗？
:
: 我做的这个基因是tumor suppressor and/or metastasis suppressor, 这个才是我做
: 的方向, 有好多老鼠的活要做.
: embryonic lethal这种事有点难, 主要是我没啥development的经验. 先干着吧. 我本
: 来跟老板说我不想lead这个project, 现在估计只有我能lead, 除非老板再招一个人干
: 活, 我就可以把这个脱手了.
: 上个月刚刚写了一个新的关于cancer的animal protocol(实验室以前没有独立的animal
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i***R
发帖数: 663 | 21 没错，这个挺关键的，我们以前有个cre 母老鼠就是有这个问题，费了挺久才figure
out.
【在 D*a 的大作中提到】
: 我们用的是Cre male，因为有的cre female在生殖细胞里面有早期表达，后代就都成
: total KO了。
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p******i
发帖数: 1092 | 22 RE
我们以前也是……是挺郁闷的……
【在 i***R 的大作中提到】
: 没错，这个挺关键的，我们以前有个cre 母老鼠就是有这个问题，费了挺久才figure
: out.
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h********n
发帖数: 4079 | 23 什么情况下会出现partial KO?
谢谢
mosaic的
【在 D*a 的大作中提到】
: 没说反么? EIIa Cre 的母鼠才应该是total KO才对么？公的EIIa－cre后代是mosaic的
: 正在做这个。
: ps 跟lz说，不光是EIIa Cre这种已知的造成后代mosaic的会这样，我现在用的一个
: camk promoter 的公的，后代也时不时出来几只 total KO，所以一般新老鼠，你要把
: 脑心肝肾皮肤什么的都做一遍pcr，还有dynamic的KO时间，来确定它是不是specific
: 的，和KO时间是不是和你想要的一致。
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n********k
发帖数: 2818 | 24 with my limited expericences, I would say promoters, positioning effects etc
etc, but no one can predict with accuracy until one does the experienment
and found out. as well, cre toxity has been observed in neuron as well...
【在 h********n 的大作中提到】
: 什么情况下会出现partial KO?
: 谢谢
:
: mosaic的
|
h********n
发帖数: 4079 | 25 谢谢.
etc
【在 n********k 的大作中提到】
: with my limited expericences, I would say promoters, positioning effects etc
: etc, but no one can predict with accuracy until one does the experienment
: and found out. as well, cre toxity has been observed in neuron as well...
|
D*a
发帖数: 6830 | 26 不知道你说的partial KO是指什么，大多数时候用cre就是为了partial KO，这个
partial是specific的patial，比如只在特定器官，或者某种特定细胞中造成KO而不涉
及其他细胞，这样就避免了用total KO或者用全身+/-的老鼠，分析实验结果时不能确
定是整体影响，还是特定细胞的特定功能。
但有的partial KO是我们不希望的，比如利用脂肪细胞中的特定promotor建立了一个脂
肪细胞中表达的cre，然后每个器官分别摘出来验证时，发现在肝中也有KO，这就是cre
是leaky的，这个当初做老鼠时很难避免，因为你也不知道你的promotor是不是多用了
一块或者少用了一块，或者旁边一个调控元件根本就是未知的，再加上后面接的又是别
的蛋白，很难预测promotor的行为，比如到底在哪里表达，什么时候表达等等。这时候
paper发表前和发表后就很容易被人critique，不过也不是不能发到好杂志上，这个原
因就不分析了哈。。。但是结果其实有可能是leaky的那部分cre造成的，而跟你本来想
KO的那个器官没有关系。。。
我现在看的一篇nature文章，我
【在 h********n 的大作中提到】
: 什么情况下会出现partial KO?
: 谢谢
:
: mosaic的
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s******e
发帖数: 370 | 27 我们做的是complete KO， 不是tissue specific，所以要从卵子开始就得有active的
cre——跟上面各位不同哈
F1出来，PCR，碰到过既有被cre切过以后产生的小带，又有未切的cKO带，就把这个叫
partial。究其原因，猜想可能是cre被transcribe出来的时间太晚又太短，受精卵分裂
之后有些细胞带了cre有些没有。
但是即使是partial，如果它的生殖细胞是KO，我们还是可以用它来establish line的。
tissue specific暂时还没有做到⋯⋯ |
s******r
发帖数: 2876 | 28 哪一篇？说来学习学习。
不知道你说的partial KO是指什么，大多数时候用cre就是为了partial KO，这个
partial是specific的patial，比如只在特定器官，或者某种特定细胞中造成KO而不涉
及其他细胞，这样就避免了用total KO或者用全身+/-的老鼠，分析实验结果时不能确
定是整体影响，还是特定细胞的特定功能。
但有的partial KO是我们不希望的，比如利用脂肪细胞中的特定promotor建立了一个脂
肪细胞中表达的cre，然后每个器官分别摘出来验证时，发现在肝中也有KO，这就是cre
是leaky的，这个当初做老鼠时很难避免，因为你也不知道你的promotor是不是多用了
一块或者少用了一块，或者旁边一个调控元件根本就是未知的，再加上后面接的又是别
的蛋白，很难预测promotor的行为，比如到底在哪里表达，什么时候表达等等。这时候
paper发表前和发表后就很容易被人critique，不过也不是不能发到好杂志上，这个原
因就不分析了哈。。。但是结果其实有可能是leaky的那部分cre造成的，而跟你本来想
KO的那个器官没有关系。。。
我现在看
【在 D*a 的大作中提到】
: 不知道你说的partial KO是指什么，大多数时候用cre就是为了partial KO，这个
: partial是specific的patial，比如只在特定器官，或者某种特定细胞中造成KO而不涉
: 及其他细胞，这样就避免了用total KO或者用全身+/-的老鼠，分析实验结果时不能确
: 定是整体影响，还是特定细胞的特定功能。
: 但有的partial KO是我们不希望的，比如利用脂肪细胞中的特定promotor建立了一个脂
: 肪细胞中表达的cre，然后每个器官分别摘出来验证时，发现在肝中也有KO，这就是cre
: 是leaky的，这个当初做老鼠时很难避免，因为你也不知道你的promotor是不是多用了
: 一块或者少用了一块，或者旁边一个调控元件根本就是未知的，再加上后面接的又是别
: 的蛋白，很难预测promotor的行为，比如到底在哪里表达，什么时候表达等等。这时候
: paper发表前和发表后就很容易被人critique，不过也不是不能发到好杂志上，这个原
|
h********n
发帖数: 4079 | 29 我以前一直做tissue specific的transgenic mice, 不是Cre.
现在用adeno-cre在肺里做肺癌/转移. 另外一个是beta-actin-Cre看看对老鼠胚胎发
育的影响, 这个应该是要完全KO.
cre
【在 D*a 的大作中提到】
: 不知道你说的partial KO是指什么，大多数时候用cre就是为了partial KO，这个
: partial是specific的patial，比如只在特定器官，或者某种特定细胞中造成KO而不涉
: 及其他细胞，这样就避免了用total KO或者用全身+/-的老鼠，分析实验结果时不能确
: 定是整体影响，还是特定细胞的特定功能。
: 但有的partial KO是我们不希望的，比如利用脂肪细胞中的特定promotor建立了一个脂
: 肪细胞中表达的cre，然后每个器官分别摘出来验证时，发现在肝中也有KO，这就是cre
: 是leaky的，这个当初做老鼠时很难避免，因为你也不知道你的promotor是不是多用了
: 一块或者少用了一块，或者旁边一个调控元件根本就是未知的，再加上后面接的又是别
: 的蛋白，很难预测promotor的行为，比如到底在哪里表达，什么时候表达等等。这时候
: paper发表前和发表后就很容易被人critique，不过也不是不能发到好杂志上，这个原
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h********n
发帖数: 4079 | 30 我有点不太明白, Cre在每个细胞都表达, 即使第一代不行, 以后应该也会被切掉啊,
能不能详细说说.
谢谢
的。
【在 s******e 的大作中提到】
: 我们做的是complete KO， 不是tissue specific，所以要从卵子开始就得有active的
: cre——跟上面各位不同哈
: F1出来，PCR，碰到过既有被cre切过以后产生的小带，又有未切的cKO带，就把这个叫
: partial。究其原因，猜想可能是cre被transcribe出来的时间太晚又太短，受精卵分裂
: 之后有些细胞带了cre有些没有。
: 但是即使是partial，如果它的生殖细胞是KO，我们还是可以用它来establish line的。
: tissue specific暂时还没有做到⋯⋯
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s******e
发帖数: 370 | 31 还是那句话，看是什么cre
我用的cre是oocyte active，受精后短暂活跃，过了那个阶段就不表达了，所以精子里
来的cre有时就不够effective。beta-actin的话应该会好一点吧
其实我接触这个也才一年多，都是trouble shooting中攒的个人经验而已 |
h********n
发帖数: 4079 | 32 谢谢.
【在 s******e 的大作中提到】
: 还是那句话，看是什么cre
: 我用的cre是oocyte active，受精后短暂活跃，过了那个阶段就不表达了，所以精子里
: 来的cre有时就不够effective。beta-actin的话应该会好一点吧
: 其实我接触这个也才一年多，都是trouble shooting中攒的个人经验而已
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m*********e
发帖数: 565 | 33 我帮你做.
animal
【在 h********n 的大作中提到】
: 我做的这个基因是tumor suppressor and/or metastasis suppressor, 这个才是我做
: 的方向, 有好多老鼠的活要做.
: embryonic lethal这种事有点难, 主要是我没啥development的经验. 先干着吧. 我本
: 来跟老板说我不想lead这个project, 现在估计只有我能lead, 除非老板再招一个人干
: 活, 我就可以把这个脱手了.
: 上个月刚刚写了一个新的关于cancer的animal protocol(实验室以前没有独立的animal
: protocol), 还好以前phd的时候写过不少类似的. 现在又写一个development的
: protocol, 这两个月都在写东西. 老板坚决不肯在animal protocol上出现他老人家的
: 名字, 所以这两个animal protocol的PI是我, 有啥事都是我的责任啊....
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S******9
发帖数: 2837 | 34 你这个beta-actin Cre是non inducible的？
我们组研究的target基因就是在胚胎11.5～12.5天的时候死掉。即使是Tie2 Cre内皮特
异性的也是的。所以我们研究的成鼠是用的beta-actin Cre是inducible的，可惜我们
的flox做的不是特别好，有leaky现象，部分老鼠实际出生的时候已经有很大的ko了，
当然用药物诱导以后可以ko掉90%。
叫你老板把我招去吧，我喜欢做老鼠model的活。做atherosclerosis，vasoactivity，
原代血管内皮培养，各种组织切片染色。 |
D*a
发帖数: 6830 | 35 提供2篇references
Cre-mediated germline mosaicism: a new transgenic mouse for the selective
removal of residual markers from tri-lox conditional alleles.
Leneuve P, Colnot S, Hamard G, Francis F, Niwa-Kawakita M, Giovannini M,
Holzenberger M.
Nucleic Acids Res. 2003 Mar 1;31(5):e21.
36.
Cre-mediated germline mosaicism: a method allowing rapid generation of
several alleles of a target gene.
Holzenberger M, Lenzner C, Leneuve P, Zaoui R, Hamard G, Vaulont S, Bouc YL.
Nucleic Acids Res. 2000 Nov 1;28(
【在 h********n 的大作中提到】
: 我有点不太明白, Cre在每个细胞都表达, 即使第一代不行, 以后应该也会被切掉啊,
: 能不能详细说说.
: 谢谢
:
: 的。
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D*a
发帖数: 6830 | 36 pdf淹没在茫茫paper大海中了 -_-lll
是关于ap2 cre和obesity / IR的一篇......
cre
【在 s******r 的大作中提到】
: 哪一篇？说来学习学习。
:
: 不知道你说的partial KO是指什么，大多数时候用cre就是为了partial KO，这个
: partial是specific的patial，比如只在特定器官，或者某种特定细胞中造成KO而不涉
: 及其他细胞，这样就避免了用total KO或者用全身+/-的老鼠，分析实验结果时不能确
: 定是整体影响，还是特定细胞的特定功能。
: 但有的partial KO是我们不希望的，比如利用脂肪细胞中的特定promotor建立了一个脂
: 肪细胞中表达的cre，然后每个器官分别摘出来验证时，发现在肝中也有KO，这就是cre
: 是leaky的，这个当初做老鼠时很难避免，因为你也不知道你的promotor是不是多用了
: 一块或者少用了一块，或者旁边一个调控元件根本就是未知的，再加上后面接的又是别
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