d*******w
发帖数: 45 | 1 在真核里表达一个蛋白, 用的vector中带有kozak sequence,但是自身克隆的sequence
中带有ATG.那在细胞内表达的时候translation是1)从vector中的ATG开始 2)从insert
中的ATG 还是3)两种都会同时发生,但是含kozak sequence的比例会比较高? 个人觉得
答案是1)因为是在表达的时候是通过scanning的,vector肯定是优先的,但是有没有第二
,三种的可能呢?谢谢赐教 |
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r****s
发帖数: 201 | 2 在新泽西附近的同学们，
哪位可以帮我扩增表达3个pichia strains?
目前我有在甘油里面保存的pichia，里面有我要的质粒， 从外地寄过来的，我没有表
达yeast的环境
需要找个附近的实验室扩增表达，每个细胞系需要在500毫升的摇瓶里面诱导表达。
如果有能够帮忙的同学，请跟我联系，有报酬。
谢谢了先 |
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s******r
发帖数: 2876 | 3 Histon H1 行不行？
所在的实验室是一个烧钱的实验室，做几十个转录因子，实验套路大致就是qPCR和
western结合检测不同基因在不同human cell line中的表达，然后挑出表达合适的细胞
系去做siRNA和Chip-seq，目的呢，找出这些转录因子的binding site以及pathway什么
的。
我其实只是一国内小硕在这里做一小技术员，可是目前实验室没有post-doc，所以这些
实验基本上就着落在我和另一技术员身上，她负责做siRNA，其它的实验都我做。
照着protocol做实验当然没问题啊，遇到不懂的没人问就难办了。可是我成天闷头赶实
验，哪里有空看文献呢，所以就只好跟science脱节了。
做qPCR还好说（其实也有困难，另行发帖请教），我用的是GAPDH作为internal
control来计算相对表达量。可是做western时，我一开始选的是GAPDH做内对照，买的
是Sigma的抗体，做的还挺好的，因为这个GAPDH检测大小是36kd，正好跟我的目的蛋白
50-75kd能分开，我转一张膜，然后剪开就可以同时检测两个抗体。可是老板在我上周
汇报结 |
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e********r
发帖数: 147 | 4 细菌里有个测序后annotated的基因（编码一个还原酶），我们有RT-PCR的证据表明这
个基因不但有正义的mRNA转录，同时也有反义的非编码RNA转录，原以为应该是个作用
于自身的cis-encoded antisense RNA，很感兴趣打算继续分析下去。
用大肠杆菌表达了这个基因的产物（表达量那叫一个高），制备了抗体以后做Western
（多抗那叫一个好），呵呵，现在麻烦出来了：至少在我们目前的诱导条件和上样量（
15 μg总蛋白）下，在该细菌里一点都没检测到这个蛋白的表达。难到它是个假基因？
那转录正义和反义干啥？这个东西自已觉得很有趣，对于如何开展下一步，请大家帮忙
出出主意，谢了先！ |
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m****m
发帖数: 395 | 5 膜蛋白难表达是很正常的事。
先把各种可能性一一排除，然后确定原因。各个击破。一次改变一个条件，一次解决一
个疑问。
关于测序的事，如果可以的话，还是想想办法做一下。
先从涂板开始，每个菌落小量摇菌，检测质粒的存在，还有生长活性。标记好有质粒的
菌，挑选最有活力的菌进一步做表达蛋白，有几个问题需要解决：OD生长到多少的时候
开始换培养基最好？（一般是对数生长期吧，不过自己也可以试一下在不同生长期）。
更换培养基后，多久以后开始诱导？（我一般是1个小时以后，不过你可能不同，要试
一下）。分几个不同的温度进行诱导（更换培养基后就用这个温度）、诱导多久后膜蛋
白表达量最高？（这个就要麻烦你要每隔一段时间取点菌去测一下有没有蛋白了）最后
决定最佳诱导温度和时间，还有你说的IPTG量的问题，也可以试一下，抗生素的浓度也
要控制好，太高菌就不长了，太低么要长杂菌。最后裂解细菌，看你用什么方法了，裂
解完离心后膜蛋白有可能在上清液里，也有可能在PELLET里。确定这个以后，就可以开
始纯化了。总之每个步骤都要严格监控，别把蛋白弄丢了。
小小建议呈上，希望对你有所帮助，祝你成功~ 实在不行，最后可以去做 |
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h**********d
发帖数: 30 | 6 好的，我也只好一个一个条件慢慢尝试了。
我是让colony在2YT里长到饱和（1.5到两天）后转入M63培养基的，这个以前也是成功
的，并
且是参照文献上类似工作做的。我一般都是从板上挑最大的几个菌落开始长，当然它们
也是长
得最快的。开始诱导都是在E.COLI进入600纳米吸收值0.6到0.7之间（我个人觉得OD高
一些有
利于细胞内低GLUCOSE，高cAMP两个条件满足引发表达，是这样么？）。
我从来没尝试过降低温度表达，因为实验室用的E.COLI C43是专门优化表达细胞色素氧
化酶这
类的膜蛋白的，我这次打算用37，30，25都尝试一下？
诱导后一半长菌4个小时，久了会形成干扰的杂质蛋白CYTOCHROME OO3,大概1，两个小
时黄色
的E.COLI就会开始变红，意味着蛋白已经积累到可以目测的程度了。
蛋白的纯化我到不担心，这个在组里已经是很常规的步骤了，首先它都在膜里的，不会
在清液
中，其次有没有蛋白从颜色就可以看出来，棕红的细胞膜就对了，呵呵。 |
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w********u
发帖数: 5457 | 7 最近头都大了，要在老鼠的cell line里面过表达和knockdown一个gene，选了L929细胞
，觉得挺简单的试验，结果两个礼拜下来，杯具了。
先是knockdown，试了siRNA pool和shRNA plasmid （4 clones），均没有knockdown效
果。重新design了shRNA，准备再试。
又做了overexpression，openbiosystem买的construct，CMV promoter （pCMV－
SPORT6 plasmid），CDS测过序列，完全正确。转染了，western blot，又啥也没有高
表达。转染效率40％－50％。
目标基因是个胞质胞核穿梭蛋白，结合RNA，功能重要但研究文献不多，表达量各个细
胞不均一，但是knockout老鼠胚胎很早死亡，无KO老鼠。
请教有经验人士，可能是啥原因？是不是L929这个细胞朱就是不容易搞啊？如果是，有
啥别的老鼠细胞容易搞的？或者还是有别的可能？
谢谢拉！ |
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r***e
发帖数: 2539 | 8 对于lenti vector，transfection能表达，但infection不表达的话，可能是
1. 质粒重组掉了一段序列（在Lenti载体中经常发生），影响你的蛋白表达。
2. transfection可以用external promoter，而infection以后只能用internal promot
er。
GFP |
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V********n
发帖数: 305 | 9 有没有什么技术是可以Screen 细胞膜上蛋白表达情况的。比如表达了哪些，表达量高
低等等，类似Array一样的技术。
能有高手帮忙一下么？先谢谢了。 |
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s******r
发帖数: 2876 | 10 天然的miRNA也有很多同时表达的吧，
你可以模拟他那个结构，用pTRIPZ来表达。
sorry,没有做过lenti， 不熟悉有哪些vector可以用。有没有哪个lentiviral vector
可以同时表达两个不同的shRNA，并且有荧光marker做FACS啊？ |
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h*******0
发帖数: 48 | 11 我觉得很多时候不表达是因为菌种污染了
不是BL21或者菌里没有质粒
只要是含表达载体的BL21，肯定可以通过诱导表达的 |
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v***a
发帖数: 1242 | 12 需要某蛋白激酶在我培养的细胞里过量表达，筛选plasmid constructs时测序是正确的
，不过大量培养后得到很多的DNA拿去测序，好像说质量不好，测序结果就没有太较真。
然后就transfect我培养的细胞，取得cell lysate做western blot，发现蛋白表达量对
照vector的control基本无变化。以前我也在相同的细胞里overexpress过一个蛋白，
work得都还好。我应该怎么做，才能用western blot看到蛋白表达量的变化呢？谢谢！ |
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S******e
发帖数: 393 | 13 个人几点想法：
1）confirm constructs 正确
2) 质粒最好纯度要高，至少不要太差
3）转化效率要高
如果蛋白较大，转染后即使有表达（比如检测tag), 但量不够，
这时用内源蛋白抗体检测时就不一定能看到差异,正如你所说的与control比没变化。
如果你的构建加tag了，就检测一下看是否已表达了，若已表达那就想办法提高转化效
率吧。
(另外还想到的是加inducible 的promoter诱导时间长一些，不知是不是可行，仅供参
考） |
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g**********t
发帖数: 475 | 14 谁说没蛋白产物就没有意义阿。有一个假说是AS相关的NMD是一种重要的调节基因表达
的机制。比如你的基因在testes里“需要”降低表达量，于是进化出一种isoform，而
这种isoform由于含有PTC会被NMD降解。这样功能产物的表达量就降低了，而且非功能
isoform被降解了，所以也没啥副作用（除了多耗了点能量）。 |
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C*********4
发帖数: 40 | 15 是不是还要看表达蛋白的e.coli,可以试试rosetta-gami,这种细菌表达含有二硫键的蛋
白好像不错 |
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A*******e
发帖数: 284 | 16 vector control 表达量奇高，所以vector没有问题，promoter没有问题，融合蛋白表
达量低，我觉得可能因为表达量高了有毒性，因为这些低表达的，表型就很强烈了。 |
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e****p
发帖数: 354 | 17 在有些细胞中，为什么只有mRNA表达而没有蛋白表达呢？有没有什么文献a? |
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s******y
发帖数: 28562 | 18 啊。。。情况很多啊，可能性也很多啊
1. 该mRNA 的表达被抑制了，比方说被miRNA，或者某些蛋白（比方说
zipcode binding protein) 抑制了
2。蛋白表达后迅速被降解 |
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f***4
发帖数: 886 | 19 这个很正常的。
检查一下你的TARGET载体构建和ROSA-YFP是不是一样，就是说整合在ROSA的位点是不是
一样。
现在存在的ROSA-YFP要比ROSA-GFP表达强很多倍，解释的原因很多，很多人同意就是整
合的位点不一样。
invitrogen) ，结果很失望，发现GFP表达弱，且阳性细胞少；同样的Cre line 和
ROSA26-YFP杂交后，同样的染色，YFP表达很强，阳性细胞很多。
lox |
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m******h
发帖数: 32 | 20 各位同仁，我最近在动物细胞中表达一个150的膜蛋白，当在C端加上一个GFP后定位和
功能都正常，然后根据实验需要（FRET），我在GFP之后又加上了一个RFP，中间以一个
50Aa的柔性linker连接。
结果我杯具了：
1，蛋白表达量急剧下降。
2，表达的蛋白都不是去外膜上了，而是trap在各种内膜上，或者说聚集在一起。
但是两个颜色的荧光还都能看见。
目前有点手足无措，不知从何开始改进，各位帮忙给支个招吧，拜谢了！ |
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w*********g
发帖数: 69 | 21 菜鸟问个问题。有人用过pVAX1做真核表达载体么？能在vero、BHK、CHO或者pk15细胞
里表达吗？有没有相关的文献啊？
小弟先谢过了。 |
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s*******m
发帖数: 24 | 22 需要大量纯化一个小蛋白，大概9KD左右。在大肠杆菌里面表达量一直不高。以前看过
一篇文章，说需要在蛋白N端第2个或者第3个氨基酸做一个突变，可以提高表达量。有
谁知道是什么突变不？或者有谁知道怎么在细菌里面大量表达小蛋白的办法不？多谢了
！ |
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T*****n
发帖数: 897 | 23 我们做microarray发现了一些基因表达降低，随后用real time PCR 也得到确认。但我
们试图用western blot及ELISA的方法去证明蛋白表达也降低时却遇到麻烦，因为
western和ELISA显示蛋白表达正常。有点想不通。大家遇到过这样的情况吗？ |
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r*****t
发帖数: 4793 | 24 建了一个质粒，pcdna 的表达His9（6-FLAG tagged 一个基因
用最开始得到的质粒作转染，有表达
用这个最初的质粒去扩增，大提得到的质粒，再去做转染，就怎么也看不到重组蛋白的
表达了
为什么为什么？ |
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h**********r
发帖数: 671 | 25 长假刚回来。我承认我逻辑更加混乱了。一直有这么个问题纠结：基因表达成蛋白质时
，需要细胞生长吗？比如说E. coli，细胞生长仅仅是稀释作用吗？最简单的IPTG诱导
时，IPTG加得过晚，整个表达量也不会高。那么这个受IPTG诱导的蛋白质的表达，主要
在新分裂的细胞中吗？E. coli的单个细胞也有从小长到大的过程吧？E. coli是不是也
有个“可遗传的诱导状态”？
也许有很多模型解释了，我也没有查。大家能发表点看法吗？多谢！ |
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e****s
发帖数: 1125 | 26 优化下IPTG看看。
再一个，如何检测蛋白表达的？Western 还是SDS电泳染色？
吧。 |
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r******t
发帖数: 629 | 27 我那个根本不在T7控制之下，压根不需要induce。
所以是constant表达我要的蛋白的～
叹气，所以很诡异啊。 |
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m******5
发帖数: 1383 | 28 楼主啊你看了你的plasmid上的原件么你是不是用了热激表达载体啊！！！！！ |
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m******5
发帖数: 1383 | 29 楼主啊你看了你的plasmid上的原件么你是不是用了热激表达载体啊！！！！！ |
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e****s
发帖数: 1125 | 30 在我看来，你这就是简单的检测灵敏度的问题，所谓瞄一眼就知道是否表达，太主观。
依靠SDSPAGE，你可能永远无法在上清里看到你的条带。30度没有inclusion body的形
成，绝对是好事情。
跑个上清的Western后，也许就一目了然。 |
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K**R
发帖数: 193 | 32 我最近用普通转染 类似于lipofectamine， 转染过表达和敲出质粒。
我发现过表达后的目的基因倍数增加比较大，而敲出后的减小倍数不是特别大。这个正
常吗？
我想问问大牛们你们一般转染后，目的基因表达倍数大概最大能达到多少倍变化啊？
谢谢了！ |
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s******y
发帖数: 28562 | 33 我们需要在酵母里同时高表达两个蛋白，但是不知道mamalian常用的那些IRES, P2A
sequence这些东西能不能用在这种场合上？
我们本来想找两个抗性不一样的表达质粒各自表达一个，但是我们能找到的都是URA
marker.这样会弄得很麻烦因为抗性没有差别。 |
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T*****u
发帖数: 3257 | 34 病毒包装和titer都挺好，为什么不表达我的蛋白？只有加到很MOI很高的时候，大概
200，才有微弱表达。这种情况是RCA污染吗？大家做腺病毒表达都用哪家的vector啊
。多谢！ |
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e***o
发帖数: 344 | 35 不好意思，我没有表达得清楚。我的主要目的是表达这几个蛋白。让他们分的比较开，
彼此没有overlap（就像DNA FISH 那样，不同的颜色分得很开，各自独立）。不然就混
到一起了，只有一个颜色了。
我想过吧他们弄到细胞膜上，或囊泡上，什么的。不知道能不能通过confocal分开。
但是这几个construct要不不带信号肽，要不都得带一样的。因为我还得做得做别的实
验。 不知道我表达清楚了没有。
感谢！ |
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i***0
发帖数: 160 | 36 ？楼主要表达蛋白干什么用，生化， 细胞，还是结构，要在哺乳动物细胞里表达么？
胞外结构域可以加一个分泌序列让他直接分泌到胞外，然后收培养液提纯即可。我们组
用昆虫细胞感染病毒表达胞外结构域分泌到培养液，免去裂解细胞离心等步骤，很方便 |
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m***7
发帖数: 62 | 37 我的目的蛋白内源表达太弱,很难检测到。希望能在不改变表达特异性的基础上，提高
蛋白的表达量。
请问有什么比较通用的方法么？尤其可以用到老鼠身上做knockin的。
谢谢！ |
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K*C
发帖数: 2825 | 38 做了个蛋白的mutant，换了200个bp左右，结果蛋白表达量在HEK293 cells里下降了20
倍。然后做了一下
qPCR，发现是RNA的问题，RNA量下降了64倍。
然后我把这个mutant的200bp分成了3段，每段60-70bp左右给突变回去wild type。结果
蛋白表达量还是和mutant一样低。然后我又回到wild type，把上面3段中其中一段突变
到mutant的序列，结果表达量还是很低。现在准备继续做剩下两段分别从wild type变
成mutant的序列。
我把这200个bp序列连带着左右各100bp贴出来大家帮忙看看吧。有没有什么奇奇怪怪的
东西会影响transcription。谢谢！
ccctggcaggccctgctcatcaatgaggaaaacgagggtttctgtggtggaactattctgagcgagttctacatcc
taacggcagcccactgtattaatcagaccaagagcgtttcagttattgtaggggaaatagacatatcaagaaaaga
aaccagacgtcttctttctgtggataaaatatat... 阅读全帖 |
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b*********8
发帖数: 44 | 39 最近想过表达一个21-22nt的miRNA,
1. 请问对于一般这个miRNA 与目标序列有多上个碱基完全匹配才能完全有效？4个碱基
错配会不会有效？
2. 一般要表达多长miRNA？只表达stem loop区段够不够？
谢谢！ |
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s******a
发帖数: 472 | 40 研究的inhibitor用DMSO溶解，所以需要DMSO的对照。但是和没有任何处理的细胞相比
，DMSO降低基因A的表达（RT-PCR). 做了一个２个小时的time course，有一个随着
DMSO处理时间增加表达下降的趋势（和无处理组相比）。但是我使用的DMSO浓度远低于
０.５（v/v），据文献报道这个浓度该细胞不应有何影响。细胞在DMSO２个小时后
viability，形态都正常。
另外研究的基因B则不受DMSO影响(RT-PCR）。
DMSO影响基因表达的可能机制都有什么？
欢迎大家指教！多谢！！ |
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q***7
发帖数: 144 | 41 如果你是做蛋白表达纯化出身的，你就知道做融合蛋白时，一般都会把后面那个基因
ATG去掉。你可以不叫他错误，但是有时候你回得到多个表达蛋白。
关于Stop codon，你可以在GOOGLE里搜索一下，真核生物（例如人）和原核生物（如E.
coli)的密码子使用频率表，你会发现他们对终止密码子，不是只用一个，而是机率不
同。只放一个终止密码子有时会造成通读，你蛋白表达纯化是有时看到比你预测的大的
蛋白有时就是通读造成的。
有什么问题欢迎提问，谢谢 |
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q***7
发帖数: 144 | 42 你拿个具体的序列来自己数一下不就知道啦？至于一个基因内部的ATG有没有可能
ribosome作为其实进入起始另外一个蛋白翻译，你可以放狗狗里搜一下，这个我没有时
间来回答
另外，一个基因在其自然情况大都是一个，这个搞大规模预测的都有这方面文章发表，
有时间了自己好好做做工课。我们这里讨论的拿到质粒上来表达，离开了其自然选择的
前后基因序列你是不确定它会选择那个来做终止密码子，为了保险做好加入要表达宿主
最偏爱的另外再加一个第二偏爱的。我们搞表达的经常会发现重做新加另外一个终止密
码子后通读就消失了。 |
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y********8
发帖数: 23 | 43 我要在细胞中表达一个Fe-S cluster SAM的蛋白， 这个蛋白活性对oxygen极为敏感，
至少有氧的情况下在E.coli中没有任何活性。
第一次把此蛋白在细胞质中表达，没有酶活。想问大家如何有何方法让此蛋白在细胞中
有酶活？把它在mitochondria中表达， 是否有帮助？
谢谢！！！ |
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C*******e
发帖数: 318 | 44 我是外行。请问公司里面蛋白药物的基因工程表达都是用什么细胞表达？ 细菌，酵母
，昆虫细胞，哺乳动物细胞？ 都用，还是主要用那些？ 有何优势？
谢谢阿 |
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v*******e
发帖数: 11604 | 45
突变是相当于去掉这个蛋白的功能，但是基因表达并不应该就一定低，失去功能并不一
定是依靠表达低，也可以是因为蛋白的某些变化使得它的某些基团的功能丧失，比如磷
酸化和去磷酸化等。如果P53突变，但是它的promoter，regulator并没有突变，我们并
不能指望它的表达会降低。 |
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m***o
发帖数: 272 | 46 IGF1 mw 17kd，mature protein 8kd。
说检测不到不准确。就是最高的是48h 10moi时可清楚看到17kd，看不到8kd。但是在
48h 5moi时17kd条带很淡。72h时17kd都十分的淡。mature的8kd蛋白都看不到，跑的20
%gel。
Qpcr可检测到mRNA的表达。是蛋白都分泌出去了吗？但是细胞内多少也该有啊？
有谁做过分泌蛋白的表达吗？什么看法？ |
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s******s
发帖数: 13035 | 47 你用啥promoter？没有TF或者clone出错，
没有表达吗mRNA自然看不到。产病毒的时候，
有病毒RNA可以表达。 |
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W*P
发帖数: 14 | 48 一直以来对在ES cell表达蛋白很头痛，总是很难达到理想的表达水平。请教版上有经
验的牛人们是用什么promoter或vector来表达蛋白的？EF1a promoter会不会比较好？
用lentivirus会比plasmid好吗？
在此先谢过各位！祝大家假期愉快！ |
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j****x
发帖数: 1704 | 49 "两个启动子CMV和SV40来启动两个基因表达"这个问题不大，有些很成熟的商用载体也
是这么干的。我以前做过几个细胞系，不同的基因都表达的很正常。
慢病毒载体插入5kb的片段，包装效率很可能会比包装1kb以下的差出2个数量级以上。
但考虑到小基因的表达也很弱，应该是载体本身有存在系统系的问题，WPRE元件缺失应
该是可能性之一。只是好奇，设计载体的人居然连这点都没考虑到。 |
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s******r
发帖数: 1245 | 50 两个机制不一定一样，过表达影响了其他东西，你的蛋白你熟啊应该能猜个大致方向出
来，比如根据功能试试换个tissue表达或者分段表达看看。起码要给个合理理由解释，
否则过不了reviewer那关 |
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