r******t
发帖数: 629 | 1 我用ecoli（BL21 DE3）表达人的cyt c，有6 his tag。
结果37度表达就有inclusion body，而30度或者室温就压根不表达，这个也太奇怪了吧。
为啥啊？
我把30度养的culture丢进37度几个小时，它们又很欢快的表达了。
唉，不知道该怎么解决这个问题。
换个cell line？ |
a****k
发帖数: 1130 | 2 J Bioenerg Biomembr. 2002 Dec;34(6):423-31.
Expression and characterization of recombinant human cytochrome c in E. coli.
Jeng WY, Chen CY, Chang HC, Chuang WJ.
Source
Department of Biochemistry, National Cheng Kung University College of
Medicine, Tainan 701, Taiwan.
Abstract
Cytochrome c is a heme protein involved in electron transfer, cell apoptosis
, and diseases associated with oxidative stress. Here we expressed human
cytochrome c in E. coli and purified it to homogeneity with a yield of 10-15
mg/L. The redox potential of recombinant human cytochrome c was 0.246 V
which was measured by cyclic voltammetry. This is similar to that of horse
cytochrome c with a value of 0.249 V. The sequential assignment and
structural analysis of recombinant human ferrocytochrome c were obtained
using multidimensional NMR spectroscopy. On the basis of our NMR studies,
the recombinant human cytochrome c produced in E. coli exhibits the same
tertiary fold as horse cytochrome c. These results provide evidence that
human cytochrome c expressed in E. coli possesses a similar function and
structure to that of the horse protein. It is known that cytochrome c plays
a role in many human diseases. This study serves as the basis for gaining
insight into human diseases by exploring structure and function
relationships of cytochrome c to its interacting proteins.
吧。
【在 r******t 的大作中提到】
: 我用ecoli（BL21 DE3）表达人的cyt c，有6 his tag。
: 结果37度表达就有inclusion body，而30度或者室温就压根不表达，这个也太奇怪了吧。
: 为啥啊？
: 我把30度养的culture丢进37度几个小时，它们又很欢快的表达了。
: 唉，不知道该怎么解决这个问题。
: 换个cell line？
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r******t
发帖数: 629 | 3 唉，这个文章我看了，质粒并不一样啊。
望天，依然没有解决我的诡异问题。 |
e****s
发帖数: 1125 | 4 优化下IPTG看看。
再一个，如何检测蛋白表达的？Western 还是SDS电泳染色？
吧。
【在 r******t 的大作中提到】
: 我用ecoli（BL21 DE3）表达人的cyt c，有6 his tag。
: 结果37度表达就有inclusion body，而30度或者室温就压根不表达，这个也太奇怪了吧。
: 为啥啊？
: 我把30度养的culture丢进37度几个小时，它们又很欢快的表达了。
: 唉，不知道该怎么解决这个问题。
: 换个cell line？
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a*******e
发帖数: 245 | 5 I do not know the reason, but I would say it is pretty normal.
吧。
【在 r******t 的大作中提到】
: 我用ecoli（BL21 DE3）表达人的cyt c，有6 his tag。
: 结果37度表达就有inclusion body，而30度或者室温就压根不表达，这个也太奇怪了吧。
: 为啥啊？
: 我把30度养的culture丢进37度几个小时，它们又很欢快的表达了。
: 唉，不知道该怎么解决这个问题。
: 换个cell line？
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r******t
发帖数: 629 | 6 我那个根本不在T7控制之下，压根不需要induce。
所以是constant表达我要的蛋白的～
叹气，所以很诡异啊。
【在 e****s 的大作中提到】
: 优化下IPTG看看。
: 再一个，如何检测蛋白表达的？Western 还是SDS电泳染色？
:
: 吧。
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e****s
发帖数: 1125 | 7 那你用ＢＬ２１ ＤＥ３干啥。
你在３７度下Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ里看见，低温下看不见，也不是什么超级
诡异的问题。特别如果你是依靠铐染来鉴定蛋白的话。３７度表达快，蛋白都在ｉｎｃ
ｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ里面，低温下，一方面细菌少，表达慢，且可能部分成为可溶
蛋白，同样体积下，Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ里的量会少很多。
所以，前面问你是怎么检测蛋白的。
不知道你用什么高级载体？不需要ＩＰＴＧ诱导，又为何用ＤＥ３菌株呢？
【在 r******t 的大作中提到】
: 我那个根本不在T7控制之下，压根不需要induce。
: 所以是constant表达我要的蛋白的～
: 叹气，所以很诡异啊。
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i***l
发帖数: 1656 | 8 GoodPoint To The 无厘头问题
【在 e****s 的大作中提到】
: 那你用ＢＬ２１ ＤＥ３干啥。
: 你在３７度下Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ里看见，低温下看不见，也不是什么超级
: 诡异的问题。特别如果你是依靠铐染来鉴定蛋白的话。３７度表达快，蛋白都在ｉｎｃ
: ｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ里面，低温下，一方面细菌少，表达慢，且可能部分成为可溶
: 蛋白，同样体积下，Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ里的量会少很多。
: 所以，前面问你是怎么检测蛋白的。
: 不知道你用什么高级载体？不需要ＩＰＴＧ诱导，又为何用ＤＥ３菌株呢？
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m******5
发帖数: 1383 | 9 楼主啊你看了你的plasmid上的原件么你是不是用了热激表达载体啊！！！！！ |
m******5
发帖数: 1383 | 10 楼主啊你看了你的plasmid上的原件么你是不是用了热激表达载体啊！！！！！ |
r******t
发帖数: 629 | 11 用de3是因为实验室有这个cell line，不用买。其实没de3也没关系。
37度有inclusion body，30度压根不表达蛋白。降温表达的目的就是增加可溶性呗。
鉴定方法是sdspage，而且蛋白本身是红色的，瞄一眼就知道是否表达。
【在 e****s 的大作中提到】
: 那你用ＢＬ２１ ＤＥ３干啥。
: 你在３７度下Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ里看见，低温下看不见，也不是什么超级
: 诡异的问题。特别如果你是依靠铐染来鉴定蛋白的话。３７度表达快，蛋白都在ｉｎｃ
: ｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ里面，低温下，一方面细菌少，表达慢，且可能部分成为可溶
: 蛋白，同样体积下，Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ里的量会少很多。
: 所以，前面问你是怎么检测蛋白的。
: 不知道你用什么高级载体？不需要ＩＰＴＧ诱导，又为何用ＤＥ３菌株呢？
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e****s
发帖数: 1125 | 12 在我看来，你这就是简单的检测灵敏度的问题，所谓瞄一眼就知道是否表达，太主观。
依靠SDSPAGE，你可能永远无法在上清里看到你的条带。30度没有inclusion body的形
成，绝对是好事情。
跑个上清的Western后，也许就一目了然。
【在 r******t 的大作中提到】
: 用de3是因为实验室有这个cell line，不用买。其实没de3也没关系。
: 37度有inclusion body，30度压根不表达蛋白。降温表达的目的就是增加可溶性呗。
: 鉴定方法是sdspage，而且蛋白本身是红色的，瞄一眼就知道是否表达。
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C*********m
发帖数: 213 | 13 en，正解。可能42度表达得更好。
【在 m******5 的大作中提到】
: 楼主啊你看了你的plasmid上的原件么你是不是用了热激表达载体啊！！！！！
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r******t
发帖数: 629 | 14 vector backbone 是 pUC18，没看见热激啊～
加入cyc1基因以后，这个vector被命名为pBCYC1.我拿到的呢，是在pBcyc1上修改过的
pBTR1.
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1046592801914
http://pubs.acs.org/doi/pdfplus/10.1021/bi972188d
没加histine tag之前一切ok，表达顺利，都是可溶性的。
加了以后就inclusion body了，然后降温表达就干脆不表达了。
我了个去。
【在 C*********m 的大作中提到】
: en，正解。可能42度表达得更好。
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