s******c
发帖数: 331 | 1 这个，首先水溶蛋白和膜蛋白并没有本质上不同，膜蛋白结构容易发好文章也是因为膜
蛋白结构很少，重要功能的或者说直接跟疾病药物相关的膜蛋白80%以上都没有结构信
息，就像早期可容蛋白的结构也容易发好文章一样，另外，膜蛋白如果可以去用EM做，
那么没有任何理由水溶蛋白不行，还是因为膜蛋白的结构信息少，所以EM的技术手段有
突破就很快用到膜蛋白上，还有，用EM去做膜蛋白结构还有很多壁垒，分子量小的（低
于100kd）没有对称性的膜蛋白仍然没有高分辨率em结构，而且对于小的membrane
protein，detergent对于电镜密度仍然影响很大，不是每个膜蛋白都可以适应amphipol
，最后，即便再过很多年em最后可以做很多膜蛋白结构，基于电子衍射的局限，仍然不
肯能到达x ray的极限分辨率，这点对于很多需要高分辨率的结构比如阐明小分子药物
结合的科学问题还是很大的不足，当然如果你的工作是paper oriented不是question
oriented可能不care，反正这个结构不行就做另外一个结构。
实际上单纯追求膜蛋白结构数量的实验室也不多见，各种结构技术手段的突破对于多数
研究膜... 阅读全帖 |
|
S***J
发帖数: 1210 | 2 Nature top10果然选了电镜，选MRC那个哥们也不算过分，不过窃以为yifan chen的贡
献也不在其下吧。
做x-ray的都知道，膜蛋白比水溶蛋白更高大上，更容易找工作，更哗众取宠一些。感
觉膜蛋白x-ray领域是把结构生物学技术工人的特点发挥到了极致，根本就不需要做什
么biology就能发好文章。不像搞水溶蛋白的，要补不少功能试验才能说个好的故事。
现在电镜出来，跟周围膜蛋白的同行们聊天，真的是都很有危机感，怨声载道。那些个
大膜蛋白，大膜蛋白复合物10几年拿不到好的晶体。现在尼玛电镜半年搞定，而且分辨
率还很高。x-ray的领地以后看来还是回归到各种水溶蛋白复合物，及各种需要高分辨
率结构的药物靶点蛋白。毕竟搞功能的同志们经常能鉴定出一些新的相互作用，x-ray
仍然可以大展身手。膜蛋白x-ray领域真的是兴盛了很短的时间就要退出舞台了，感慨
啊。。。 |
|
g*****p
发帖数: 451 | 3 你确信你的蛋白是膜蛋白？做过细胞定位么？
很多膜蛋白的猜测都取决于疏水区的预测
而疏水区有可能只是在折叠的时候位于蛋白核心而已，不见得真的是膜蛋白
你的结果不是意外不意外的问题
如果我看了这样的实验结果，直接会强烈质疑你文章的技术方法的可性度
从你对膜蛋白确证以及测活的方法学一定会要求你逐步讲个清楚
再没有合理解释之前，我完全无法信任你基于该蛋白的任何重要发现的claim |
|
C**S
发帖数: 522 | 4 用一个膜蛋白拉下来几个细胞骨架蛋白，大家觉得该怎么往下做，是不是没什么意思？
膜蛋白一定是和骨架蛋白有结合吧，没查到几篇文章研究膜蛋白和骨架蛋白作用的文章
，是不是大家觉得这都是已知的？ |
|
S***J
发帖数: 1210 | 5 分子量小的膜蛋白可以上抗体，然后电镜搞定，这个已经证明可行了。
水溶蛋白之所以不用电镜，还是因为x-ray优势更大，很多时候x-ray做得更快，分辨率
更高。当然，水溶蛋白不如膜蛋白好发文章也是一个原因。
目前看来，膜蛋白结构领域有更多lab是paper oriented，水溶蛋白结构圈要好不少，
估计是水溶蛋白lab如果不focus，那真的是很难生存了。
amphipol |
|
发帖数: 1 | 6 第一个建议真的很有用 我一定试试
A和B确实都是一次跨膜蛋白
我也非常怀疑是否是false positive
确实用的NP40 buffer 提全蛋白（7号针头抽吸）
但现在结果是A和B的全长和cleavage都作用
而且cleavage要比全长作用强很多 且cleavage在胞内部分
所以我想这样B cleavage是否就不算膜蛋白 也就不行成micelle
为了避免这种可能 所以做截段看作用位点 这样也能抛开膜蛋白特性
不管如何还是希望尽快确定是false还是true
RIPA |
|
m****m
发帖数: 395 | 7 膜蛋白难表达是很正常的事。
先把各种可能性一一排除，然后确定原因。各个击破。一次改变一个条件，一次解决一
个疑问。
关于测序的事，如果可以的话，还是想想办法做一下。
先从涂板开始，每个菌落小量摇菌，检测质粒的存在，还有生长活性。标记好有质粒的
菌，挑选最有活力的菌进一步做表达蛋白，有几个问题需要解决：OD生长到多少的时候
开始换培养基最好？（一般是对数生长期吧，不过自己也可以试一下在不同生长期）。
更换培养基后，多久以后开始诱导？（我一般是1个小时以后，不过你可能不同，要试
一下）。分几个不同的温度进行诱导（更换培养基后就用这个温度）、诱导多久后膜蛋
白表达量最高？（这个就要麻烦你要每隔一段时间取点菌去测一下有没有蛋白了）最后
决定最佳诱导温度和时间，还有你说的IPTG量的问题，也可以试一下，抗生素的浓度也
要控制好，太高菌就不长了，太低么要长杂菌。最后裂解细菌，看你用什么方法了，裂
解完离心后膜蛋白有可能在上清液里，也有可能在PELLET里。确定这个以后，就可以开
始纯化了。总之每个步骤都要严格监控，别把蛋白弄丢了。
小小建议呈上，希望对你有所帮助，祝你成功~ 实在不行，最后可以去做 |
|
e********r
发帖数: 147 | 8 我们用最常用His tag + Ni-NTA（未加detergent）纯化到了一个可溶的细菌膜蛋白（
pET30a, 两个跨膜区）。虽然量很少，但有活性。Western blot和MS都鉴定该蛋白是正
确的。我们用这个蛋白做了论文里所有的实验。诱导条件是12度，24小时，0.5 mM
IPTG。
论文审稿后问题不大，但有个审稿意见让我们说明一下是“怎么纯化得到膜蛋白的”。
我猜专家是做蛋白结构的所以觉得很意外，但我怎么回答他比较合适呢？总不能说“我
纯化到了，所以我纯化到了吧”，这样审稿人会发怒滴，呵呵。请各位给个合理的建议
，谢谢。 |
|
e********r
发帖数: 147 | 9 我们用最常用His tag + Ni-NTA（未加detergent）纯化到了一个可溶的细菌膜蛋白（
pET30a, 两个跨膜区）。虽然量很少，但有活性。Western blot和MS都鉴定该蛋白是正
确的。我们用这个蛋白做了论文里所有的实验。诱导条件是12度，24小时，0.5 mM
IPTG。
论文审稿后问题不大，但有个审稿意见让我们说明一下是“怎么纯化得到膜蛋白的”。
我猜专家是做蛋白结构的所以觉得很意外，但我怎么回答他比较合适呢？总不能说“我
纯化到了，所以我纯化到了吧”，这样审稿人会发怒滴，呵呵。请各位给个合理的建议
，谢谢。 |
|
e********r
发帖数: 147 | 10 我们用最常用His tag + Ni-NTA（未加detergent）纯化到了一个可溶的细菌膜蛋白（
pET30a, 两个跨膜区）。虽然量很少，但有活性。Western blot和MS都鉴定该蛋白是正
确的。我们用这个蛋白做了论文里所有的实验。诱导条件是12度，24小时，0.5 mM
IPTG。
论文审稿后问题不大，但有个审稿意见让我们说明一下是“怎么纯化得到膜蛋白的”。
我猜专家是做蛋白结构的所以觉得很意外，但我怎么回答他比较合适呢？总不能说“我
纯化到了，所以我纯化到了吧”，这样审稿人会发怒滴，呵呵。请各位给个合理的建议
，谢谢。 |
|
h******y
发帖数: 351 | 11 请教大家，我想找一个膜蛋白A（最好膜蛋白A的表达具有细胞特异性），可以帮助非膜
蛋白B定位在细胞外膜上。请专家给介绍几个例子。
多谢！ |
|
发帖数: 1 | 12 多谢回复
我是真核里慢病毒稳转
蛋白是一次跨膜蛋白
做coIP验证相会作用位点的
胞外和胞内区域都拉不出
后来分别加上跨膜区 就都能拉出来了
所以我想单独做一个跨膜区表达 做coip
想证明是跨膜区相互作用的
看作用强弱 所以表达量应该还是要有的吧
我可能比较傻了 以为跨膜单独拎出来就行
不知道您的建议是如何？
感觉阁下经验很丰富 大谢 期盼建议 |
|
m****m
发帖数: 395 | 13 做好的膜蛋白脂质体样品，需要用extruder过滤一下，该膜蛋白有疏水部分，也有一半
以上亲水部分，请问那个滤膜会不会吸附蛋白呢？很担心损失样品。
在用透析方法做脂质体的时候，还发现一半蛋白进入不了磷脂形成脂质体，而是溶在缓
冲液里，造成大量浪费，这是什么原因呢？该怎么样解决一下啊？想听听大家的意见想
法 |
|
h**********d
发帖数: 30 | 14 好的，我也只好一个一个条件慢慢尝试了。
我是让colony在2YT里长到饱和（1.5到两天）后转入M63培养基的，这个以前也是成功
的，并
且是参照文献上类似工作做的。我一般都是从板上挑最大的几个菌落开始长，当然它们
也是长
得最快的。开始诱导都是在E.COLI进入600纳米吸收值0.6到0.7之间（我个人觉得OD高
一些有
利于细胞内低GLUCOSE，高cAMP两个条件满足引发表达，是这样么？）。
我从来没尝试过降低温度表达，因为实验室用的E.COLI C43是专门优化表达细胞色素氧
化酶这
类的膜蛋白的，我这次打算用37，30，25都尝试一下？
诱导后一半长菌4个小时，久了会形成干扰的杂质蛋白CYTOCHROME OO3,大概1，两个小
时黄色
的E.COLI就会开始变红，意味着蛋白已经积累到可以目测的程度了。
蛋白的纯化我到不担心，这个在组里已经是很常规的步骤了，首先它都在膜里的，不会
在清液
中，其次有没有蛋白从颜色就可以看出来，棕红的细胞膜就对了，呵呵。 |
|
b*******3
发帖数: 99 | 15 膜蛋白做Western Blot需要用PNGase F去掉N端糖基?
我现在在做一个膜蛋白的Western Blot,这个膜蛋白的基因序列前辈被我加了一个FLAG
的标签构建立一个表达载体pcDNA3,然后转染到细胞HEK293中.筛选后构建了稳定的细胞系.
免疫染色,药理学都很正常.(如果没有转染成功不会有这么强的药理现象.)
抗FLAG的一抗,做Western Blot却做不出来.
是不是需要用PNGase F去掉N端糖基再做呢?有必要?
PNGase F去掉N-linked carbodydrates?和去糖基是一个意思?
谢谢
N-Glycosidase F (PNGase F) is a ~36 kDa amidase that cleaves at the
innermost N-acetylglucosamine (GlcNAc) and asparagine residues of high
mannose, hybrid, and complex oligosaccharides from N-linked glycoproteins. |
|
发帖数: 1 | 16 我只是做过很多tail anchored protein，有一些经验。
我觉得你说的已经可以充分证明作用区域在TMD。如果现在设想的单纯用TMD的办法又表
达量很低，那么可以考虑swap TMD。就是找另一个在细胞膜上毫不相干的跨膜蛋白质，
挑它的TMD，就找中间20个非常疏水的AA应该没有问题，swap到你蛋白质里，然后做
CoIP。这个不相干的蛋白质作为negative control。这样可以保证你的蛋白质TMD外围
信号不变。
但是要提醒你，如果蛋白A和蛋白B都是跨膜蛋白，CoIP出来的结果可能是假阳性，特别
是你用的detergent只有NP40，并且negative control是cytoplasmic protein，比如
free GFP。那么AB会CoIP，negative control不会。因为NP40是弱detergent，我怀疑
membrane在buffer里被打成了micelle， 所以AB同在micelle里一起被IP。如果用RIPA
buffer你会发现AB不CoIP了，当然你也可以认为RIPA buffer太强了。所以除了CoIP最
好有其他证据证... 阅读全帖 |
|
t*d
发帖数: 1290 | 17 EGFR 是如雷贯耳。不过不知道是这么重要的药物靶点。多谢！
去google了一下，EGFR 是个膜蛋白，在很多癌细胞中高表达。大部分 EGFR 的
inhibitors 直接就抑制癌细胞的生长了。我的一个想法是，利用癌细胞特异表达的膜
蛋白来帮助给药。EGFR 之类的蛋白当然是个很好的目标，也确实有人利用它设计给药
系统。不过如果我们只把条件定为在癌细胞膜特异表达（但不一定和癌细胞的生长直接
相关），应该可以找到更多的潜在靶点。这些靶点可以不是药物的直接target，但是可
以帮助设计更好的给药系统，比如 Mark Davis 的nanoparticle。
我想建一个癌细胞膜表面特异表达的数据库。也许能混一篇文章在NAR的database 专刊。 |
|
C**S
发帖数: 522 | 18 我们老板对什么都感兴趣，除了技术上难做的。所以我们实验室通常也就拿个siRNA干
扰，测个信号通路之类的。到处捡别人剩下的渣吃。
如果是真的，该怎么接下来做？我唯一能想到的就是说这个膜蛋白和spectrin结合，来
控制tumorigenesis。我已经有了这个膜蛋白胞内段不同deletion，在肿瘤细胞
overexpression后肿瘤大小不同的结果。 |
|
i***l
发帖数: 1656 | 19 “不用Detergent，还是可溶的细菌膜蛋白”？
这会是每个人的都有疑问--为什么没有Detergent就能提纯？还有活性？
（你也没说怎么破碎的 哪里表达的，Assuming是大肠，超声波。）
我估计，可能极少数穿莫蛋白和细胞膜在破碎过程中形成MICELLS，然后过柱子时候被你
拿到了。如果NTA柱子挂了蛋白后变成黄色，或者你的Elute是浅黄色，就很有可能是有
膜成分共同被结合，洗脱了。当然如果及少量，也可能看不到颜色变黄。
不怕麻烦的话，可以挑个简单的实验 加温和的Detergent （OG，DM，等等温和但是CMC
大点儿的），看看结果是不是一样。
Pierce的手册里有很好的关于Detergent的介绍 |
|
r********r
发帖数: 104 | 20 有人做过细胞核外膜膜蛋白的表达吗？ 如果是在真核细胞里面表达，是不是要先在ER
中，再转运到细胞核上去插膜？ |
|
L****S
发帖数: 76 | 21 考虑同时染CD44/CD24 和HISTONE （DURAL IMMUNOSTAINING）， 但是CD44/CD24 是膜
蛋白，实验室以有的透膜方法 （TRITON, ACETONE,SAPONIN) 都尝试了，但是无论用哪
种方法， 透膜后，CD44/CD24 所剩无几。 但是不透膜，又染不出HISTONE。
大虾们有什么好的PROTOCOL 吗？
拜谢。 |
|
t*d
发帖数: 1290 | 22 有多少癌细胞有已知的特异的膜蛋白？
对这些有特异膜蛋白的癌细胞，是不是可以利用抗体把药物（比如简单的砒霜）带过去
，特异性杀死癌细胞？ |
|
C**S
发帖数: 522 | 23 你这个跟我前不久遇到的问题一样。膜蛋白N端都含有一个signal peptide，表达到膜
上以后会被切掉。tag如果装到signal peptide之前，会一同被切掉。要装在N端就得装
在signal peptide之后。
你的蛋白的确成功表达了，但tag被切掉了，所以WB检测不到。
FLAG
胞系. |
|
s******y
发帖数: 28562 | 24 具体得看你是哪个膜蛋白。
不是所有的都和骨架蛋白有关联的，只有少数几个。
但如果你是用质谱作出来的话，很可能只是污染而已，因为骨架蛋白丰度太高了，
经常是随便啥都能拉下来 |
|
s******y
发帖数: 28562 | 25 看你老板想不想这么做。如果想做的话必须先用western 来证明。
然后用纯化的蛋白来证明。
在做之前，先查查有没有人做过那个膜蛋白和骨架蛋白的关系，以及
功能上是否重要。 |
|
s******y
发帖数: 28562 | 26 哦，是和spectrin 有关啊？
spectrin 经常会在膜旁边晃悠。貌似和某些膜蛋白应该有关系。
就看你们老板乐不乐意往下做了。 |
|
l*********1
发帖数: 351 | 27 谢谢
我想我的问题可能应该更加具体点
最好是这样的膜蛋白：
癌症细胞表面overexpression。同时该膜蛋白的胞外区可以存在于细胞质中，胞外区发
挥重要生物学功能（酶/蛋白质相互作用）。 |
|
s*******e
发帖数: 1010 | 28 估计人家想问的是怎么不用detergent就纯化到了膜蛋白，潜台词是你怎么保证膜蛋白
在无detergent体系中保留了正常功能和天然构象。 |
|
q******g
发帖数: 3858 | 29 做MS时， 是否能看到脂类的峰呢？ 或者有什么脂的标记物， 可以证明你的蛋白是和
膜上的脂一起洗脱下来。或者找个文献，看看是否有人用类似的方法纯化出膜蛋白。 |
|
n**********7
发帖数: 29 | 30 大家好。
我最近在用flow检测一种膜蛋白的表达。对于这种蛋白，现有的用于flow的抗体都是
recognize c－terminal的，所以只能做intracellular flow。我的基本步骤是分离细
胞后，加Fc block，fix，permeablize，0.5% BSA block buffer,然后分别染一抗和二
抗，只有single color。
现在遇到的问题是，这种蛋白在treatment之前，不仅在细胞表面有表达，也存在于
intracellular vesicles里，所以不知道permeablize之后会不会检测到的量不仅仅是
表面的表达量。具体应该怎么做才能够保证我仅仅检测到cell surface的量呢？或者除
了flow之外还有其他的方法更适合解决这个问题？
多谢了！
做这个实验有两个多月了，反复试结果都不好，真着急！！ |
|
a*****n
发帖数: 2835 | 31 想做screening，希望能够直接用膜蛋白和分泌蛋白的
library，好像听说过有这样的sub library。请问版上哪位朋友有这方面的信息？多谢！ |
|
s******y
发帖数: 28562 | 32 我觉得是。
除非是膜蛋白被回收降解的时候，没有降解完全的细胞外片断不小心又通过
lysosome 的膜跑进细胞液内部了。 |
|
v*********d
发帖数: 382 | 33 1 膜蛋白在ER里合成，golgi里修饰 最后运到目的地。
2 细胞内到处都是膜
3 抗体只有少数1部分能用来染色，还有特异性的问题。最好通过比较文献和
overexpress tagged protein 来确定抗体是不是可靠好用
nuclear |
|
s******y
发帖数: 28562 | 34 如果这个膜蛋白从来都没有人知道可以和spectrin 有关系的话，
那么你们还是有不少东西可以做的。
的确spectrin和癌症是有一定关系的。 |
|
h********0
发帖数: 944 | 35 我感觉同种抗体识别膜蛋白和细胞内蛋白在信号强度上可能会有差别，不知道流式仪能
不能足够敏感去检测得到 |
|
发帖数: 1 | 36 我最近纯化一个膜蛋白，昨晚跑了一晚上柱子，然后今天一大早送去旁边楼里的core
facility要做个质谱。可能是昨晚熬夜，肠胃出了问题，送完sample我突然就想拉屎。
这楼特旧，厕所不干净，通风也不好，巨臭。我一般是不在这楼里拉屎的，可是没办法
，这回，实在是想拉了。打开坑门儿一看，太他妈恶心了，马桶圈子上沾着屎粑粑星子
。我忍着恶心劲儿，扯了10张擦手纸，5张沾了洗手液，5张不沾。然后我先用沾了洗手
液的擦了5次，又用不沾洗手液的擦了5次，总算把马桶圈儿擦得像新的一样。
因为刚用手擦完沾屎粑粑星子，我决定再忍一分钟，把手洗干净再拉屎，以防传染性病
。他妈的，我刚开水龙头洗手，一个黑影就以迅雷不及掩耳盗铃之势冲进了坑位，把门
关上了。
我愣了10秒钟吧，然后我就开始敲门。我说Why you take me seat? Why you take me
seat? Why you take me seat? 我一直敲了一分多钟，里面的人只管拉屎，也不理我。
我摇摇头正要认倒霉，结果里面一个河南口音骂了一句“神经病”
我一听气得太阳穴都炸了，我说你他妈的你丫才有神经病，草尼玛妈妈的。你他... 阅读全帖 |
|
s*******e
发帖数: 1010 | 37 65C以上膜蛋白会沉出来很难进SDS-PAGE。我一般根本不加热直接上样 |
|
s*******e
发帖数: 1010 | 38 一般whole cell lysis 10uL要加20uL的loading buffer（4x）
另一个方法是先加入30-40mM DDM把膜蛋白溶出来，离心取上清再上样。缺点是要求细
胞的量大一些，不然不好操作 |
|
l**n
发帖数: 109 | 39 膜蛋白SDS-PAGE样品不要煮，否则会聚集，另外要多加SDS和DTT/BME |
|
Z****o
发帖数: 999 | 40 如题：现在研究膜蛋白结构和功能关系的牛Lab有哪些？
不是那种纯粹解晶体结构的lab。而是研究Ion channel/transporter/receptor的，一半侧
重结构分析，一半侧重功能分析，最好再带上点和疾病的相关性。
不知道这个领域今后前途如何？这个应该是和drug transporter的设计属于同一领域。
目前有哪些牛Lab和PI啊？
希望高手进来指点一下。 |
|
Z****o
发帖数: 999 | 41 恩，这种正好！太nice的老板有时候没有idea，对实验的整体方向把握得不够强势。
还有哪些研究膜蛋白的结构功能的大牛啊？HHMI的最好。
过几个星期就准备开始套磁了。 |
|
r********g
发帖数: 109 | 42 如果一个跨膜蛋白在内质网和细胞膜上都表达的话，那么是否朝向内质网腔面的部分一
定在细胞膜外？有没有可能反过来？
谢谢！ |
|
r********g
发帖数: 109 | 43 谢谢！我也没听说过。 是不是从跨膜蛋白的结构、转运和插入机制上来说是不可能反
过来的？ |
|
v***a
发帖数: 1242 | 44 很多文献所指的膜蛋白，我用其的抗体染细胞，结果大部分都是cytoplasmic/nuclear
的染色很强，cell surface的染色有的甚至都没有，不知道是怎么一回事？大家有碰到
过吗？ |
|
v***a
发帖数: 1242 | 45 我做了好几个膜蛋白，都出现类似的情况。抗体有识别cytoplasmic的，也有识别
extracellular的。我用的methanol固定的。是固定剂的缘故吗 |
|
v***a
发帖数: 1242 | 46 不是……但是有一个做的膜蛋白的染色跟一篇JCB的paper上的一样，核周染色很深（但
细胞不是同一种）。这个能算match吗？不知道如果写paper如何解释？ |
|
f*******l
发帖数: 99 | 47 我做过的那个膜蛋白有14个transmembrane domains and several glycosylation
sites,也看到过和你类似的smear.
我用的lysis buffer/IP buffer 是30mM n-Octyl-beta-D glycopyranoside or 10mM
CHAPs buffer,都可以看到清晰的单条带（最常见的glysylated form)
上样前一定不能煮，要用8M Urea buffer RT 处理。 |
|
|
|
Z******5
发帖数: 435 | 50 手头有1000多个基因，想找出其中所有的膜蛋白？请问有什么快速简洁的做法？ |
|
