b*******3
发帖数: 99 | 1 膜蛋白做Western Blot需要用PNGase F去掉N端糖基?
我现在在做一个膜蛋白的Western Blot,这个膜蛋白的基因序列前辈被我加了一个FLAG
的标签构建立一个表达载体pcDNA3,然后转染到细胞HEK293中.筛选后构建了稳定的细胞系.
免疫染色,药理学都很正常.(如果没有转染成功不会有这么强的药理现象.)
抗FLAG的一抗,做Western Blot却做不出来.
是不是需要用PNGase F去掉N端糖基再做呢?有必要?
PNGase F去掉N-linked carbodydrates?和去糖基是一个意思?
谢谢
N-Glycosidase F (PNGase F) is a ~36 kDa amidase that cleaves at the
innermost N-acetylglucosamine (GlcNAc) and asparagine residues of high
mannose, hybrid, and complex oligosaccharides from N-linked glycoproteins. |
s*******e
发帖数: 1010 | 2 N-linked glycoproteins 指的不是N末端糖基化 |
D****g
发帖数: 275 | 3 是不是你95度加热denature你的samples了，如果是的话，试一下37度10min Denature
或者直接上样。
FLAG
胞系.
【在 b*******3 的大作中提到】
: 膜蛋白做Western Blot需要用PNGase F去掉N端糖基?
: 我现在在做一个膜蛋白的Western Blot,这个膜蛋白的基因序列前辈被我加了一个FLAG
: 的标签构建立一个表达载体pcDNA3,然后转染到细胞HEK293中.筛选后构建了稳定的细胞系.
: 免疫染色,药理学都很正常.(如果没有转染成功不会有这么强的药理现象.)
: 抗FLAG的一抗,做Western Blot却做不出来.
: 是不是需要用PNGase F去掉N端糖基再做呢?有必要?
: PNGase F去掉N-linked carbodydrates?和去糖基是一个意思?
: 谢谢
: N-Glycosidase F (PNGase F) is a ~36 kDa amidase that cleaves at the
: innermost N-acetylglucosamine (GlcNAc) and asparagine residues of high
|
b*******3
发帖数: 99 | 4 有什么说头?
好象多数人都是要高温变性啊.
谢谢你的提示哦.
能具体说说吗?给个连接吧.
Denature
【在 D****g 的大作中提到】
: 是不是你95度加热denature你的samples了，如果是的话，试一下37度10min Denature
: 或者直接上样。
:
: FLAG
: 胞系.
|
C**S
发帖数: 522 | 5 你这个跟我前不久遇到的问题一样。膜蛋白N端都含有一个signal peptide，表达到膜
上以后会被切掉。tag如果装到signal peptide之前，会一同被切掉。要装在N端就得装
在signal peptide之后。
你的蛋白的确成功表达了，但tag被切掉了，所以WB检测不到。
FLAG
胞系.
【在 b*******3 的大作中提到】
: 膜蛋白做Western Blot需要用PNGase F去掉N端糖基?
: 我现在在做一个膜蛋白的Western Blot,这个膜蛋白的基因序列前辈被我加了一个FLAG
: 的标签构建立一个表达载体pcDNA3,然后转染到细胞HEK293中.筛选后构建了稳定的细胞系.
: 免疫染色,药理学都很正常.(如果没有转染成功不会有这么强的药理现象.)
: 抗FLAG的一抗,做Western Blot却做不出来.
: 是不是需要用PNGase F去掉N端糖基再做呢?有必要?
: PNGase F去掉N-linked carbodydrates?和去糖基是一个意思?
: 谢谢
: N-Glycosidase F (PNGase F) is a ~36 kDa amidase that cleaves at the
: innermost N-acetylglucosamine (GlcNAc) and asparagine residues of high
|
b*******3
发帖数: 99 | 6 如果标签被切掉的话,那么immunofluorescence就不会成功啊.
可是我的免疫荧光实验却很成功,可以看到细胞的膜部分很亮的荧光.
而MOCK细胞却没有.
免疫荧光实验也是用的抗FLAG的一抗.
【在 C**S 的大作中提到】
: 你这个跟我前不久遇到的问题一样。膜蛋白N端都含有一个signal peptide，表达到膜
: 上以后会被切掉。tag如果装到signal peptide之前，会一同被切掉。要装在N端就得装
: 在signal peptide之后。
: 你的蛋白的确成功表达了，但tag被切掉了，所以WB检测不到。
:
: FLAG
: 胞系.
|
C**S
发帖数: 522 | 7 是很奇怪，会不会是signal peptide切掉后还有一些吸附在细胞膜/extracellular
matrix上？
【在 b*******3 的大作中提到】
: 如果标签被切掉的话,那么immunofluorescence就不会成功啊.
: 可是我的免疫荧光实验却很成功,可以看到细胞的膜部分很亮的荧光.
: 而MOCK细胞却没有.
: 免疫荧光实验也是用的抗FLAG的一抗.
|
s*******e
发帖数: 1010 | 8 65C以上膜蛋白会沉出来很难进SDS-PAGE。我一般根本不加热直接上样
【在 b*******3 的大作中提到】
: 有什么说头?
: 好象多数人都是要高温变性啊.
: 谢谢你的提示哦.
: 能具体说说吗?给个连接吧.
:
: Denature
|
b*******3
发帖数: 99 | 9 加得进入吗?HEK293细胞被捻碎后?经常都是加了很臭的液体后,就变硬,很难加进入.
【在 s*******e 的大作中提到】
: 65C以上膜蛋白会沉出来很难进SDS-PAGE。我一般根本不加热直接上样
|
o*****a
发帖数: 2335 | 10 歪个楼请教一下，你的pCDNA转染293后能稳定保持多长时间？为什么有人说传几代后就
没了 |
|
|
b*****u
发帖数: 75 | 11 Maybe for western assay you can have a positive control with a Flag-
tagged cyotosolic protein. In the mean time, you can also make a new
construct with Flag on the c-terminal. In most cases it is hard or
impossible to predict the potential side effect of tagging, so it might
be good to try tagging on the other terminus. good luck,
FLAG
胞系.
high
【在 b*******3 的大作中提到】
: 膜蛋白做Western Blot需要用PNGase F去掉N端糖基?
: 我现在在做一个膜蛋白的Western Blot,这个膜蛋白的基因序列前辈被我加了一个FLAG
: 的标签构建立一个表达载体pcDNA3,然后转染到细胞HEK293中.筛选后构建了稳定的细胞系.
: 免疫染色,药理学都很正常.(如果没有转染成功不会有这么强的药理现象.)
: 抗FLAG的一抗,做Western Blot却做不出来.
: 是不是需要用PNGase F去掉N端糖基再做呢?有必要?
: PNGase F去掉N-linked carbodydrates?和去糖基是一个意思?
: 谢谢
: N-Glycosidase F (PNGase F) is a ~36 kDa amidase that cleaves at the
: innermost N-acetylglucosamine (GlcNAc) and asparagine residues of high
|
s*******e
发帖数: 1010 | 12 一般whole cell lysis 10uL要加20uL的loading buffer（4x）
另一个方法是先加入30-40mM DDM把膜蛋白溶出来，离心取上清再上样。缺点是要求细
胞的量大一些，不然不好操作
【在 b*******3 的大作中提到】
: 加得进入吗?HEK293细胞被捻碎后?经常都是加了很臭的液体后,就变硬,很难加进入.
|
b*******3
发帖数: 99 | |
i***0
发帖数: 160 | 14 Please check the method part of this paper, Immunoblotting of Rhodopsin."
Probing mechanisms of photoreceptor degeneration in a new mouse model of the
common form of autosomal dominant retinitis pigmentosa due to P23H opsin
mutations."Sakami S, Maeda T, Bereta G, Okano K, Golczak M, Sumaroka A,
Roman AJ, Cideciyan AV, Jacobson SG, Palczewski K.J Biol Chem. 2011 Jan 11.
[Epub ahead of print] |
b******3
发帖数: 377 | 15 请问95度denature，我把水烧开大概97度有什么问题么？
Denature
【在 D****g 的大作中提到】
: 是不是你95度加热denature你的samples了，如果是的话，试一下37度10min Denature
: 或者直接上样。
:
: FLAG
: 胞系.
|
b****r
发帖数: 17995 | 16 37度蛋白真的会变性吗？
不变性的话不是有抗原被隐藏的危险
Denature
【在 D****g 的大作中提到】
: 是不是你95度加热denature你的samples了，如果是的话，试一下37度10min Denature
: 或者直接上样。
:
: FLAG
: 胞系.
|
l**n
发帖数: 109 | 17 膜蛋白SDS-PAGE样品不要煮，否则会聚集，另外要多加SDS和DTT/BME |
b*******3
发帖数: 99 | 18 能不能给一个详细说明的联结呢?
第一次听说.
如果可以不变性,那干嘛还有变性这个步骤呢?
【在 l**n 的大作中提到】
: 膜蛋白SDS-PAGE样品不要煮，否则会聚集，另外要多加SDS和DTT/BME
|
b*******3
发帖数: 99 | 19 To denature, use a loading buffer with the anionic denaturing detergent
sodium dodecyl sulfate (SDS), and boil the mixture at 95-100°C for 5
minutes.
Heating at 70°C for 5-10 minutes is also acceptable and may be preferable
when studying multi-pass membrane proteins. These tend to aggregate when
boiled and the aggregates may not enter the gel efficiently.
http://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/WB-beginner.pdf
Denature
【在 D****g 的大作中提到】
: 是不是你95度加热denature你的samples了，如果是的话，试一下37度10min Denature
: 或者直接上样。
:
: FLAG
: 胞系.
|
b*******3
发帖数: 99 | 20 不知道做不出来的原因到底是什么.
1不应该95度DENATURE
2应该去糖基化
3其他 |
b*******3
发帖数: 99 | |
C**S
发帖数: 522 | |
