r**i
发帖数: 514 | 1 dna纯度对酶切效率有影响。
最好每次不要切很多，可以分多份切。
也算是在分子这块混迹十几年，再拿这个弱智问题来请教高人实在不堪。直接说吧，低
拷贝数质粒，要切的量很高，要求回收后能达到100ng/ul. 没办法，猛养细胞，猛提质
粒，所有的试剂盒被我抛弃，达不到我的要求，还费钱。手提，溶液1，2，3乙醇沉淀
什么的折腾，量上基本没有什么问题。 两个酶，Asc I 和 Not I, 双切，感谢NEB,这
两个酶现在可以在同一个buffer里切，回收，问题来了，总是切不干净，转化后总有空
质粒，极度讨厌这个转化后的空质粒。酶切的时间都是超过24h， 酶的量也大大的多。
请问这是为啥？ 这还能切不干净？ 还有一个引申问题，是不是所有的酶切都是切不干
净的，如同化学里面的只能达到平衡？请高人指点。
附加问题，达人们有无什么胶回收试剂盒推荐？ 我总觉得现在用的QIA和Promega的效
率不好，从没有达到所说的90% |
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A*******e
发帖数: 284 | 2 谢谢诸位！我这个是因为需要建library，最好达到10(9)，最低也得10（7）才
能说得过去，所以要求很高的浓度和效率。也有可能是自连，就是在两个酶只有一个酶
成功切了，而另外一个没有切的情况下，肯定自连。因为需要连接的效率，所以ALK之
类的处理被排除。也不想分布酶切，因为首先有共用buffer，其次我不想多纯化一次损
失我的vector.按诸位的意见，我打算降低单个酶切反应dna的量试试看。另外我这两个
酶切位点相距12bp，我想不会相互干扰。 这12bp中还有另外一个酶切位点，也是同样
的工作buffer，我想先用双酶切后，再加点这个酶，争取把那些漏网之鱼逮到干掉。
诸位有好主意，请不吝赐教！谢谢 |
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x*****e
发帖数: 309 | 3 看来做酶切的人还不少。其实双酶切分两步应该可行，先用对酶切要求比较高（查NEB
附录上需要保护碱基较多的酶）的酶切，反应完后加直接加第二个酶切：不用回收DNA
。这里有人问buffer不同怎么办的问题，查查哪里不同，一般也就是NaCl浓度差异，缺
啥补啥，自己加点调成第二个酶用的buffer就可以了。我现在空质粒双酶切完直接乙醇
沉淀回收（小片段沉淀不下来？）：加2倍体积无水乙醇，可选加1/10体积3M醋酸钠，-
20度大于20分钟，14000rpm*15min回收DNA,70% 乙醇洗2遍，风干后10-20ul水溶解（1-
2 ug DNA），如果有大的插入片段就走胶回收吧。 |
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k*******s
发帖数: 214 | 4 gDNA酶切有几个注意事项
1. gDNA一定要干净，质量好。酶切之前要跑胶看看。
2. 酶切体积要大些，1ug的要50uL体积更好
3. 酶要多加些，一般要总体积的5%
4. 酶切反应时间可以延长到overnight. 一般在反应几个小时后，可以再加几ul酶继
续切。
5. 最后跑胶应该是很好的smear现象。
酶切gDNA一帮可用来做Southern blot.
200ng/ |
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C*******e
发帖数: 4348 | 5 你说的太笼统了
一般我们说“酶切”不加别的限定的时候大家第一反应都是“DNA双链限制性内切酶”
蛋白水解酶不是我研究的东西，所以我也就是瞎说哈：
看样子你的意思是说你们做一个试剂盒检测待测样品中是否含有某一种蛋白水解酶
血浆里面是不是有不止一种可以作用于你的底物上的蛋白水解酶呢？
如果是的话你要弄清楚到底有哪些可能遇到的别的蛋白水解酶
它们在你用的底物上酶切位点以及识别位点是什么
跟你这个试剂盒针对的酶的酶切位点以及识别位点有什么区别
然后在根据这样的综合信息来决定底物肽链上哪些氨基酸需要修饰 |
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A*******e
发帖数: 284 | 6 也算是在分子这块混迹十几年，再拿这个弱智问题来请教高人实在不堪。直接说吧，低
拷贝数质粒，要切的量很高，要求回收后能达到100ng/ul. 没办法，猛养细胞，猛提质
粒，所有的试剂盒被我抛弃，达不到我的要求，还费钱。手提，溶液1，2，3乙醇沉淀
什么的折腾，量上基本没有什么问题。 两个酶，Asc I 和 Not I, 双切，感谢NEB,这
两个酶现在可以在同一个buffer里切，回收，问题来了，总是切不干净，转化后总有空
质粒，极度讨厌这个转化后的空质粒。酶切的时间都是超过24h， 酶的量也大大的多。
请问这是为啥？ 这还能切不干净？ 还有一个引申问题，是不是所有的酶切都是切不干
净的，如同化学里面的只能达到平衡？请高人指点。
附加问题，达人们有无什么胶回收试剂盒推荐？ 我总觉得现在用的QIA和Promega的效
率不好，从没有达到所说的90% |
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p*****n
发帖数: 981 | 7 ☆─────────────────────────────────────☆
sixtn (人在天地间如风中飞絮!!!) 于 (Mon Jan 29 00:24:15 2007) 提到:
最近，我在做一个双酶切的连接。最开始，在已经联入T simple vector的A段DNA序列
的一端有相隔四个碱基的两个酶切位点（XbaI和BamHI），然后用双酶切的方法把B段
DNA序列（两端带有相同的两个酶切位点）连进去。跑胶和回收都没有问题，大小也对
。但用T4酶或其它连接试剂盒连接后，再转化，总是长不出来。但其它同学用相同的试
剂做其它连接却能够轻而易举的长出来。已经做了三次了。对于原因百思不得其解，回
想实验过程是再简单不过，加液体这些也很难出错呀。化转也是很简单的步骤。不知道
哪里可能出问题了。
各位ggjj帮我分析一下可能原因好吗？多谢！
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goooo1111 (i!) 于 (Mon Jan 29 00:33:53 2007) 提到:
相隔四个碱基是不是少了一点？有些酶不切DNA尾巴， |
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x*****e
发帖数: 309 | 8 建议1.看看酶活性单位的定义，One unit is defined as the amount of enzyme
required to digest 1 µg of λ DNA in 1 hour at 37°C in a total
reaction volume of 50 µl. 切超螺旋质粒提高到5-10倍。确定你加的酶足够，
但不要超过总体积的1/10； 2.看看两个酶切位点之间距离是否大于6nt，小于还是选其
他酶吧。3.如果不能同时切，可以先用低盐buffer,切好后再补NaCl变成高盐buffer,加
第二个酶。 Good luck! 其实如果是刚要来的质粒，怎么切都不行的话，还是测序吧。 |
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s*****g
发帖数: 87 | 9 建议做几个control实验, 可能是连接或者转化的问题：
1. BamHI 单酶切 vector，链接，转化
2. EcoRI 但酶切 vector，链接，转化
3. BamHI/EcoRI 双酶切 vector，只链接vector， 转化
4. BamHI/EcoRI 双酶切Vector 和 Insert, 链接，转化
5. 转化没有酶切过的vector |
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s*****g
发帖数: 87 | 10 建议做几个control实验, 可能是连接或者转化的问题：
1. BamHI 单酶切 vector，链接，转化
2. EcoRI 但酶切 vector，链接，转化
3. BamHI/EcoRI 双酶切 vector，只链接vector， 转化
4. BamHI/EcoRI 双酶切Vector 和 Insert, 链接，转化
5. 转化没有酶切过的vector |
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s*****g
发帖数: 87 | 11 建议做几个control实验, 可能是连接或者转化的问题：
1. BamHI 单酶切 vector，链接，转化
2. EcoRI 但酶切 vector，链接，转化
3. BamHI/EcoRI 双酶切 vector，只链接vector， 转化
4. BamHI/EcoRI 双酶切Vector 和 Insert, 链接，转化
5. 转化没有酶切过的vector |
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d*********o
发帖数: 6388 | 12 http://science.caixin.com/2020-03-10/101526576.html?originReferrer=weibo_caixinwang
bioRxiv论文的通讯作者之一、中国科学院西双版纳热带植物园副研究员Alice
Catherine Hughes对财新记者表示，“人工干预没有任何证据，这种病毒显然（
clearly）是从野生动物起源和进化而来的。”
研究认为，来自蝙蝠的冠状病毒可能提供了新冠病毒的基因骨架，与蝙蝠或其他野生动
物的进一步重组事件，则使它获得了S蛋白、RBD和多碱基剪切位点
【财新网】（实习记者 黄晏浩 记者 徐路易）新冠病毒又一项“特殊性”在自然界中
找到了类似物。3月6日，一篇发表在bioRxiv预印本网站的论文称，S蛋白两个亚基S1和
S2间的蛋白酶切位点有多个氨基酸插入，并非新冠病毒独有，一种新的蝙蝠冠状病毒
RmYN02的S蛋白同样存在类似插入。研究团队认为，这一结果有力证明了类似插入可以
自然发生，新冠病毒起源于蝙蝠和其他野生动物中存在病毒之间的多重自然重组。论文
尚未经过同行评议。
该论文题目为《一种新的蝙蝠冠状病毒揭示了... 阅读全帖 |
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b******s
发帖数: 1089 | 13 虽说理论上这两个酶在大部分buffer里活性都不错。但实际上并不一定所有的组合都好
用。
尤其是有时候在非最佳的buffer里会有star acticity。如果同时做双酶切出现问题，
可以考虑做sequential digestion。你不必每步都抽提，可以先用离子浓度低的buffer
第一个酶先切，然后换成离子浓度高的buffer，用第二个酶切。如果切的时间足够长，
酶量足的话，我觉得不一定要加CIP，这样会促进其后的连接效率。 |
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h******y
发帖数: 1374 | 14 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: StephenKing (88), 信区: Biology
标 题: 弱弱地请教酶切问题！！！
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Apr 29 22:03:59 2011, 美东)
我最近酶切质粒（PMD-18T)总是切的相当不好，能切开，但是切开的目的带特别弱，质
粒很亮，我guarantee质粒浓度没问题，会不会是目的带弱质粒本身的碱基数太多了？
我用的酶是ASCI和NCOI，请高手指点，不胜感激！
PS：我在考虑可不可以加大上样量，或者在酶切体系中少加点水？
PPS：我以前博士做的是bioinfo，现在博后为了跟一个NAS的大佬，被强迫做bench
work，这一年来非常痛苦。进展很慢。只有一篇文章，刚写好，压在老板手里，还没改。
我是不是应该转回bioinfo？ |
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c****1
发帖数: 1095 | 15 酶切空质粒确实比较麻烦。我的经验是，一次酶切后，纯化，再酶切，再纯化，再酶切
。三轮过后，基本就没有没切开的了。
其实，插入片段也是个方法，你怕环状DNA跑的快，就插入个大点的片段，这个应该难
度不大。
BTW，为什么要这么大量？让我们开开眼？ |
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m*********7
发帖数: 606 | 16 首先，你有没有确定这个菌的chromosome有多大？有没有你这两个酶的酶切位点？
其次，按照识别位点6个碱基来算，4096个bp才能随机出现一个EcoRI的位点，考虑正反
向的话减一半就是2048bp。你跑胶的浓度是否合适来区分切开和没切开的状态？
你的描述中并没有出现非酶切对照，你是如何判断没切开的？
另外，你的实验目的是什么？为啥要用这两个酶来切？ |
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b******s
发帖数: 1089 | 17 限制性内切酶里是有glycerol的，浓度太高会影响酶切反应。两个酶体积加起来最好不
要超过整个反应体系的20%。你以前链接没成果原因很多。试试不加CIP处理，延长酶切
时间看看。
取的。 |
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l*******c
发帖数: 478 | 18 曾经尝试做DNA片段连入载体，没成功。有人建议说把其中的双酶切那步分成两步做，
后来试了，还是不行。我想稍后把流程贴上来请大家指导。
我想先问一下：做双酶切（BAMH I 和 ECOR I ），两个酶同时切和分成两次切，有很
大区别吗？你们一般怎么做呢？
谢谢大家啦！ |
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j****x
发帖数: 1704 | 19 没做过酶切回收测序，因为除非特殊情况（比如长重复序列）基本上没有这个需要。但
是PCR产物回收测序算是routine这没有什么疑问吧。你们测序中心给出的解释，类比一
下，个人觉得很牵强。我专门打电话给测序公司的技术支持，人家说没有任何问题，而
且常用的qiagen等胶回收试剂盒的说明上也写得很清楚，回收后的片断可直接用于测序
反应（参考试剂盒说明或主业）。
1. 胶回收自然会影响得率，一般损失在50%以上，但是只要你能保证回收后测序模板的
浓度（一般而言20-30ng/ul足够了），就没有问题，这应该是不难办到的。大不了酶切
体系做大一点，质粒多用一点而已。
2. 胶回收过程中DNA的变性复性没有那么夸张，如果是单链DNA有可能形成不规则结构
，双链除非特殊情况，还是很稳定的，你的酶切产物和一般的PCR产物没有本质的不同
，测序上自然也没有明显的差异。建议你问问他们是不是PCR产物胶回收测序也不能做
，如果是这样的话，那就没什么可说的了，建议你送公司测序吧，你们的测序中心不靠
谱。
不知道你们那里是什么情况，反正我们这里的测序中心就是垃圾。硬件倒是很好，2台
454，2台GA，还有好几... 阅读全帖 |
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S*********g
发帖数: 24893 | 20 我最近酶切质粒（PMD-18T)总是切的相当不好，能切开，但是切开的目的带特别弱，质
粒很亮，我guarantee质粒浓度没问题，会不会是目的带弱质粒本身的碱基数太多了？
我用的酶是ASCI和NCOI，请高手指点，不胜感激！
PS：我在考虑可不可以加大上样量，或者在酶切体系中少加点水？
PPS：我以前博士做的是bioinfo，现在博后为了跟一个NAS的大佬，被强迫做bench
work，这一年来非常痛苦。进展很慢。只有一篇文章，刚写好，压在老板手里，还没改。
我是不是应该转回bioinfo？ |
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m**h
发帖数: 381 | 21 不好意思，上来问个比较愚笨的问题，请大家不要笑话。
老板让做一个漂亮一点的示意图，大意是选取一种已知的bacteria的genome，然后选取
一种限制型内切酶或者是几种内切酶的组合，在fragmentate整个genome的同时，把长
约1Kb的目标基因A切成均匀的大约200－300bp左右的片断。需要局部放大显示基因A的
序列信息和酶切位点。
请问用什么DNA分析的专用软件能做出这样的图？还是要用photoshop之类的软件自己画
？谢谢了！ |
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A*******e
发帖数: 284 | 22 请问我两个酶有共用buffer，为什么还要分布切呢？ 空质粒双切后直接乙醇沉淀
后做克隆可以吗？ 这样没有背景？我决定切下拉的片断应该也能沉淀下，这样就会有
背景啊。愿闻其祥，请赐教啊。
曾有labmate双切后用PCR纯化试剂盒做回收纯化，一直不成功，我提醒说这样酶切
的片断也能回收回来，不要迷信回收试剂盒，什么多大的片断回收不下来之类的全不可
靠。后来换胶回收就成功了。
NEB
DNA
，-
1- |
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m******5
发帖数: 1383 | 23 求教：
我在做一个做knock in mice用的大质粒（12k)
单酶切后是一条12k的线性化的带
但切胶回收后跑胶，12k的带变淡，却出现两条很浓的9k和6k的带。
实验室同学怀疑是star activity,但鉴于我跑的是切胶回收后产物，我怀疑是长质粒自
身缠绕形成的结构，跑得比较快
请教大家遇到过这种情况么？（再次强调酶切后跑胶只有一条带，6k和9k的带是胶回收
后跑胶时出现的） |
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o****u
发帖数: 214 | 24 一般的商业性特异蛋白酶识别序列都是在酶切位点前方的。
比如Factor Xa是: xxxLEGR/xxxx
有没有人知道有什么酶具有酶切位点后方特异性的？
比如xxxx/LEU(某个序列)xxx |
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l*******c
发帖数: 478 | 25 哈哈哈，SHAKURAS你太幽默了！
谢谢楼上大家的鼎力相助哈，太好了，看来我有望解开当年的谜了。
我顺便把酶切的反应量列出来，大家看看。都是FERMENTAS的。
我想问：双酶切对两种酶量的比例有没讲究？
ddH2O 30UL
DNA 7UL
10XTANGO 10UL
BAMH I 2UL
ECOR I 1UL |
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e***o
发帖数: 344 | 26 不知道哪位大侠有做过这个ECOP15I的酶切。说明书要求head to head的双位点才能效
果最佳。我现在的是tail to tail的双位点。酶切很不稳定，偶尔切得动。不知道有没
有什么好的办法可以提高效率。非常感谢！ |
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h*****9
发帖数: 4028 | 27 太高了。通常都是1-2ug/50ul。另外你的酶量加太多Glycerol可能会对酶切不利。
回收只要是跑胶纯化，未梅切质粒污染应该非常少。 |
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c****9
发帖数: 95 | 28 我正在做一种固氮菌的酶切。chromosome材料应该没问题的，quantification是200ng/
ul.所以我用了5ul的chromosome, 1ul EcoR1， 4ul Eco buffer， 30ul diH2O.再分开
入4个小试管里面，保存在37度的水浴里面分别5MIN, 30MIN, 1H, 2H,然后移入65度的
水浴30分钟，再跑胶，但是做了2次，发现DNA都没有被切开。然后换了HindIII和NEB
Buffer2,结果也是没有切开。请教各位这个是哪个环节出问题了呢？是否有更好的办法
做酶切呢？谢谢。 |
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c****9
发帖数: 95 | 29 我昨天刚收到的DNA序列测试结果，用软件分析后发现里面没有酶切的迹象。但是我之
前已经用过ECOR1酶切了,并且进行LIGATION。所以序列中应当有ECO SITE的。请问啥原因会导致这种情况的产生呢？谢
谢。 |
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s***o
发帖数: 1189 | 30 请问测序高手，
construct 经限制性酶切后 做胶回收 然后 酶切片断 可否测序？？
课题需要，在construct里构建double sequence （～2.5kb）。测序遇到麻烦。
谢谢 |
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s*******e
发帖数: 1010 | 31 貌似单酶切链接总是反向连接产物多一些，似乎携带无意义编码的DNA的质粒总是比有
意义的具有生存优势。colony PCR几乎是必须的后续手段，酶切鉴定我一般都不做。 |
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I***a
发帖数: 13467 | 32 有的时候不同的酶用不同的buffer，
如果双酶切的buffer对一种酶活性影响很大时，就分开做，
如果影响不大，就一起做。 |
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g*****y
发帖数: 6325 | 33 为什么要这么高的浓度转化呢？ 我每次就切1ug. 胶回收，然后ligation, 转化都能挑
到正确得质粒。还有酶切一般我都不会
切超过2ug／tube. qiagen胶回收。 |
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g*****y
发帖数: 6325 | 34 general rule is : 加入得酶不超过酶切总体积得1/10. |
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m*********7
发帖数: 111 | 35 pBluescript SK+ 用BamHI 完全单酶切后,得到的线性DNA片断(约3.0kb，没有用去磷酸
酶处理)用Qiaquick PCR purification kit纯化，纯化后的线性DNA保存在水里，在没
有DNA ligase的情况下，该DNA片断稳定么?会不会自连成环呢?
请大拿们不吝赐教，3x in advance! |
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T**********t
发帖数: 1604 | 36 sanger测序一开始的几十bp都不准的，如果测序引物离酶切位点太近就测不出来了。
你有目标片段就说明酶切成功了，不用担心这个问题。 |
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p*****c
发帖数: 1506 | 37 不要用空质粒，
找一个这两个位点间有insert的质粒，酶切完以后跑胶，把大小不对没切完全的分掉 |
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g*****y
发帖数: 6325 | 38 200ul体积实在太大了。 酶切总体积不应该超过50ul. 如果需要切很多，应该分几个
tube, 比如5个tube, 40ul/tube. 跑胶
后在合并起来。我觉得你放太多dna。 |
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m******5
发帖数: 1383 | 39 目的片断连进载体以后，双梅切验证，发现酶切产物比PCR目的片断大：（目的片断
500bp, 跑出来接近800）
请问这种情况正常么？
等测序结果还要三天……忐忑阿 |
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h*****m
发帖数: 1034 | 40 DNAMAN可以干这活，输入一段核苷酸序列，用Restriction菜单里的“Silent mutation”
命令，可以把不改变氨基酸序列的情况下所有可能突变产生的酶切位点列出来。
如果你没有DNAMAN，google一下"silent mutation”，或许能找到其它有此功能的软件。 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 41 反正你要胶回收的
酶切结束以后，只要是NEB的buffer 2,3 或者4，直接加点CIP进去37度1小时就可以了
然后一样胶回收
我不喜欢QIAGEN的胶回收kit
效率不高
绝对没有90%
lz可以试试ZymoResearch的胶回收kit
直接上他们家网站，要free sample
不喜欢也不用花钱买了 |
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b******n
发帖数: 4225 | 42 可能连进了两个拷贝的目的片段吧
你看看两个酶切位点是不是cohesive |
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s********n
发帖数: 2939 | 43 个人比较倾向于用colony PCR screening，通量比双酶切高不少。 |
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n***w
发帖数: 2405 | 44 PCR不如酶切好，稍有污染，PCR容易出现false postive...
我做fusion protein都好几个月了。。。现在就是把这个大片段连到backbone里去老是
得不到正确的克隆。。。。 |
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S******l
发帖数: 14311 | 46 用酶切buffer与loading buffer一起上样看看 |
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s***o
发帖数: 1189 | 47 谢谢大家，和测序中心几个人交流后，
得到一个比较合理的解释：
酶切会影响得率，对非high copy的plasmid影响尤其严重。
而gel回收在融胶时候，会有DNA的变性和复性，有的序列可能形成不规则结构比如三链。
估计要把insert subclone到比如 T-easy里面了。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 48 嗯，鉴于坑王不是专业生物男，是有可能出现这种错误的。
建议坑王把没有酶切的片段跑在同一个胶上看看尺寸对比。
另外一个建议就是坑王最好赶快转回生物信息，如果连这种小事都搞不定的话 |
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m******5
发帖数: 1383 | 49 前的状况是单酶切AGEI,用T4ligase过夜后转化
菌系试过DH5alpha和Top 10。
所有连接都是反向的。
目前的情况是质粒没法做任何改动，只能在insert上做手脚，但问题是不知道症结在哪
里从何改其 |
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m******5
发帖数: 1383 | 50 18个酶切验证阳性的克隆
这个东西plasmid比较大（13k）不太好连，这18个是从200多个克隆里挑出来的…… |
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