f*****9
发帖数: 6768 | 1 改改那个壳蛋白的编码就可以感染人类了，酶切加连接，随便找个土千老就可以做 |
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发帖数: 1 | 2 土鳖那三脚猫的功夫逃不过美国专家的火眼金睛，酶切或者质粒插入clone表达方法都
是固定那么几种 |
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发帖数: 1 | 3 厉害了我的国，中共怎么可能比欧美国家差呢？！尤其超限战研究方面绝对是独步全球
。这个基因病毒武器非常符合中共的性格，只要能赢，死多少人都不重要！与此相反的
武器就是美国的地狱火导弹，只杀目标，不伤及无辜！这两者在一起比一比，谁是垃圾
，一目了然！
：土鳖那三脚猫的功夫逃不过美国专家的火眼金睛，酶切或者质粒插入clone表达方法都
：是固定那么几种 |
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发帖数: 1 | 6 如果病毒学家能有一套令人信服的理论来证明PRRA插入是纯天然的，或这个PRRA能够被
证明是非关键furine酶切位点，那我能够接受 |
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发帖数: 1 | 7 这图我老早就发过，furin酶切最爱是RXXR这种 |
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发帖数: 1 | 8 它们都没有，
只有老鼠的肝炎病毒有这个PRRA酶切位点 |
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S*******y
发帖数: 575 | 9 他们好像把合同里那个“....we are unable to guarantee the results...”当成护
身法宝了，扯起皮来还狠强势。故事有点长了，内容加时间！！
去年10月中跟他们测DNA 文库，和序列分析（各quote了一个order），我送之前做了很
多前期工作，选取那些有共同序列（PCR并sanger测序确认），并且是overlap的（酶切
验证，互不相同）的fosmid，结果送测序的8个fosmid中，只有半个是我想要的序列，
即便这个测到共同序列的fosmid也只assemble到了一半的插入序列（fosmid应该插入
40kb左右）。11月底拿到序列，12月初拿到assemble的序列，turn around time还是正
常。但是，序列里至少一半左右的data是大肠的genome，更重要的是，对于8个formid
，花费了$10K左右，只有半个是有用序列，确实太让我失望了，所以12月开始基本就跟
他们反馈这个事情（这里我也要承认一点，第一次搞fosmid没经验，确实有E coli
genome污染，也贪心，除了8个fosmid外，还一起测了3个细菌的g... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 10 苏州智核企业简介：
苏州智核生物医药科技有限公司是中国唯一的同时从事基于单域抗体分子影像技
术和代谢组平台技术的肿瘤精准诊断的高新技术企业。智核生物已获得薄荷天使基金投
资，同时已经建立了超过1000平方米研发中心，超过30人的研发团队，其中硕士以上学
历超过90%，同时公司拥有世界一流科学家组成的顾问团队；研发硬件投入超过1000万
元，能够同时进行单域抗体筛选与肿瘤显影剂的精准生产，目前已经具有全套的分子影
像研发管线，包括单域抗体筛选平台、单域抗体人源化平台、影像技术早期评价平台。
同时旗下拥有代谢组学品牌——帕诺米克TM/BionovogeneTM，具有完整的预处理
平台和多台高分辨率质谱平台以及自主知识产权的数据分析系统，已经形成了具备完善
的生物标记物发现能力和临床应用能力；其中BioDeepTM数据分析模块已经完成了流程
化及云平台部署，同时更多的信息模块正在实现整合，“互联网+”的模式增加了代谢
组学产品的互动性。
现有岗位：
一、代谢组学研发总监
工作职责：
1.负责公司整个代谢组学项目运营；
2.根据公司的总体规划，积极有效的安排组员完成代谢... 阅读全帖 |
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i****w
发帖数: 38 | 11 故事有点长，写的有些乱，但可能对大家有帮助，同时也寻求大家的帮助。
情况有些复杂。今年六月份，我的印度老板（他也是系主任）很不好意思的跟我说不跟
我续下一年的合同（DS2019的终止日期是12-15-2011），让我开始找工作。同系的一个
台湾老板知道后，主动来找我说让我到他实验室去。他的实验室情况是，只有他老婆一
人，两个人来到这个系里刚刚两年，还没有拿到R01，手里的starting funding到明年9
月底截止，让我跟他拼一年，出些文章。这个台湾老板是assistant professor，发过
Cell和Molecular Cell的一作，他老婆也发过Gene Dev的文章，是assistant research
professor, 我本人并不害怕work hard，而且考虑到老婆在附近的工作，所以也就答
应了。9月底的时候，我在印度老板实验室的一作文章被接受了，他就跟台湾老板商量
，让我先去台湾老板实验室做，同时等学校的paper work，但这只是他们私下的协议，
不能公开。
我加入台湾老板实验室后，噩梦就开始了。他对我的paper work的事并不热心，而且对
我也... 阅读全帖 |
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r******y
发帖数: 21907 | 12 他让我们的technician做了太多的研究方面的工作，我们最近一直在做southern，他把很
多工作都交给technician干，从酶切跑胶到转膜杂交显影都包了，当然我也做，我自己的
那部分，可是他给techinician这么多研究方面的工作，弄的technician MM没时间准备实
验试剂，枪头，ddH2O什么的都没弄，害的我得自己干，我觉得这么做不太对，哪儿有给t
echinician这么多研究工作做得呀？偶觉得tech就是帮忙准备东西，灭菌啦，洗瓶子啦什
么的，是不是这样啊？我看别的实验室都是这样的，不过也可能是我们人太少，工作多做
不过来吧，总之我觉得这种安排不是很妥当。而且，老板买了个新电脑，摆在techinicia
n的桌子上，那是让我用不让我用啊，他打我进实验室就说要给我买电脑，现在买了一个
也不说给不给我用，我一直都用自己的laptopa来着，我也不是说要跟他挣，自己的lapto
pa用着也顺手了，东东都在里头，可是也该给偶一个明确的交代吧。一会儿等清闲了跟他
问问去。 |
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f*****a
发帖数: 7 | 13 Technician怎么啦! 酶切跑胶, 转膜...?
如果你觉得这些事情全该由你自己来干, 说
明你比Technician未必强在哪里!!! |
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a***a
发帖数: 40617 | 14 一个PCR，一个酶切，一个电泳
快的话5小时吧 |
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p*******w
发帖数: 311 | 15 也许我跟你做的不一样。
PCR 一个就要五小时左右。
酶切一般过夜，电泳最快2小时。 |
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M********e
发帖数: 2528 | 16 看到这里，忍不住就笑了。
转基因玉米主要是转了bacillus thuringiensis的一个基因。这个基因所生成的蛋白BT
只能溶解于强碱的胃里。人类还有其他动物都是含有强酸的胃，所以该BT蛋白就直接排
除体外了。
而insect昆虫的胃是强碱的胃，强碱会溶解该蛋白，溶解后的蛋白会被其他蛋白酶所酶
切，成为有活性的蛋白，造成昆虫胃穿孔
而死亡。
而大家所宣扬的organic food农场是怎么种玉米的呢？或者怎么种庄稼的呢？毕竟虫子
还在啊，要吃啊。
事实上, 在organic 农场， 是直接喷bacillus thuringiensis细菌。在过去60年，至
少有100万吨该细菌被喷在蔬菜和水果上。
所以呢，就忍不住笑了。
因为你如果吃你的有机organic food,你如果只是一般洗菜的话，你吃organic food比
你吃gmo food,要多吃10倍左右的BT 蛋白。
除非你仔仔细细的刷菜，记得要仔仔细细拿毛刷子刷，刷到每个细菌都要洗掉，否则你
吃到的BT比gmo更多奥。 |
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F******7
发帖数: 4765 | 17 【 以下文字转载自 Working 讨论区 】
发信人: Bioview (生物学人), 信区: Working
标 题: 气愤：干得好，反被开除
关键字: 工作，失业，找工作，博士后
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Jun 28 03:48:32 2013, 美东)
大家听说过因为干得不好，被公司开除之事。很少听过因干得好，被公司开除吧。下面
我就讲讲我自己的亲身经历。一则让大家给评评理。二则，也给大家提个醒，千万别象
我一样吃亏。
先大致介绍一下我自己。来美国10多年，先读生物博士，后为博士后（虽然以后的
title换成了Scientist）。我本人对科研有兴趣，因为能吃苦，有自己的科研思路，深
得博士和博士后导师的赏识。这么多年一直朝Faculty方向努力。文章发得中等偏上。
若在金融危机前，找个Faculty可能还行。可不幸的是偏偏赶上了这场危机，连着找了
好几年，虽每年都有interview但离成功总是差那么一点。去年下半年，决定不再作
Faculty的梦，去工业界试试。今年初找到一家。这是一家中国人开的制药公司在大洛
杉矶地区。我应聘的职位是在它的新药开发中心作S... 阅读全帖 |
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w*******e
发帖数: 109 | 18 google了一阵子没什么结果...板上的生物phd帮个忙吧,
酶切 这个词英文是什么? |
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r*********n
发帖数: 13992 | 20 对于能折腾的人来说，苹果不是一个好载体。。。
就像一个plasmid，设计完了就是让你直接转化转染的，没加几个可用的酶切位点，所以你折腾起来就得多费劲。。 |
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C***l
发帖数: 2625 | 21 这种质疑本质上是这么回事，倒韩的认为发表了作品，比赛获奖这些都是他生活中的大
事，要是这都记不淸一定心里有鬼。但是这么说吧，对广大wsn来说，高考箅不算大事
？考G算不算大事？我他妈把大家当年各自做过的高考题拿出来让你们再做一遍做不到
当年的分数就把你们的学位一撸到底，当你高考作弊，你要做出了，我再说你是背好了
答案，然后分别问你和你爹高考前的细节，答不出来也算作弊，这谁敢出来应答？
同样的，我叫方轴子现在马上给我默写出10%SDS-PAGE 的配方，或者EcoR I, BamH I
的酶切位点，写错了就说他博士学位是假的，这公平么？
平心而论，要是韩寒伙同一帮文艺公知来对转基因和中医，临床试验指手画脚，我也一
样骂韩寒是傻13，可方现在挂着个N年前的高考语文状元的名头来打HH的假，这就好比
一个高考生物状元去打王小东的假，这叫扯淡。 |
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d*******s
发帖数: 918 | 22 facebook确实没多少意思，是个在等酶切时浪费时间的地方，还不如看几篇文献。 |
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z*****3
发帖数: 15515 | 24 码工都是高富帅吧，最后一段改成 明天又能多做几个酶切了 更好 |
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m**d
发帖数: 21441 | 25 酶切菌 是不是很危险，一旦落在皮肤上就把人体分解了？ |
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h****n
发帖数: 2552 | 26 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: midwestPstD (中西部博士后), 信区: Biology
标 题: 请教CRISPR行家-HDR Template Design
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Nov 18 16:24:10 2014, 美东)
看了Zhang Feng的Nature Protocol关于CRISPR的文章，Figure 6里面的ssDNA
template明显的效率比plasmid作template高。文章并没有明确说明哪个template好。
想了一下，ssDNA分子量比plasmid小多了，同样的ug template, ssDNA的分子数肯定多
多了，也许这是一个解释。
我自己在设计HDR template，想两边各一个Kb的homologous arm,中间有60-70bp 的
mutation insertion。这个两kb的DNA准备克隆到一个plasmid里面，sequencing确定
mutation后，就可以用作HDR template了。
想请教的是：需要把这个两Kb的template从plasmid里... 阅读全帖 |
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L**********t
发帖数: 42 | 27 那时候读川端康成的文章,总是诧异于他对生活的处理,那样的平静,
没有一丝火气,就不能理解,怎么,难道生活中没有清醇的太阳了么,
没有脸颊的红晕和松林中啜吸朝露的爱人了么?这样的生活如何能够
忍受呢,没有了最简单最隐秘的希望,看来几乎就是没了欢乐
一段时间的忙碌,在家里,一个个白昼和夜晚的流逝淡漠而缺乏色彩,
此时对着屏幕的面孔散光似的难以固定在一个位置,窗外的地方亮着
一扇扇的窗,那里望不见。人头必然的存在着,或者会有人打着哈欠旋
开涂改液在微卷的本子上涂抹,微微颤动肩头,或者是一个想家的少年
绷紧棱角分明的嘴角在信笺上写写停停吧,也或者会有人打盹,在半开
的窗前,初秋的晚风走自己的路,或者,奢侈点,会有人傻傻的微笑,失
神的眼正对着我的寂寥,或者吧,而我却只是听着音乐,等着酶切的
结果---光线的错落也颇不均匀
偶尔会想到以前的某段时光,想起一些现在很少见到的朋友,戏剧性张
开的双臂从来不曾真的合拢过,在眼睛下面和脚的上面,一直固执的生
存着,这是太土气的说法,一般的修饰是这样的,在泪水的下面和汗水的
上面,再加上一个词---飘浮,就颇有一点境界了,但是干嘛这么苛刻呢.
不就是欢乐么 |
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r******y
发帖数: 21907 | 28 我的ligation死活不出东西，原来一做就出，现在折腾多次未果，昨天colony PCR除了
带结果质粒酶切后nothing，一定要在节前做出来，生物同修们，有啥建议？我订了新的
ligase，估计是buffer冻容多次就不好了？ |
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c**A
发帖数: 1474 | 29 first of all, everything could happen in biology.. hehe..
so, for trouble shooting:
1. run gel to check your sample before digestion but after
purification.
OK --> digestion problem
smear --> purification problem.
2. if purification problem, try to use a PCR purification kit.
3. if digestion problem.
A. make sure the fragment you cloned did not contain any
HindIII/EcoRI
B. try a sequencial digestion..
4. just a reminder:
HindIII will have prolbem to cut when your si |
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c*******o
发帖数: 8869 | 30 digestion of PCR product can be very tricky, what i do is following:
1 purify your PCR product with qiagen kit
2 use T4 PNK phosphorylate your PCR product's blunt end
3 ligate your blunt PCR fragment into any vector cutted with blunt end enzyme
(like EcoRV)
4 transformation and mini prep plasmid
5 then use hindIII and EcoRI cut the fragment out of vector
6 purify your hindIII-EcoRI fragment with kit and insert it into the vector
you want to use
this will add one more subcloning step but i am sur |
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z***h
发帖数: 998 | 31 搞个TOPO-TA载体前4步10min之内完成 |
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s**x
发帖数: 138 | 32 我研究一种蛋白.一个有趣的现象是: 该PROTEIN(NOT ENZYME) 有2种形式, 一种 有功能,
令一种没有.该蛋白55KD, 糖基化后分泌到细胞外, 分子量80KD.WESTERN BLOT只有一条带
.不可能通过酶切来调节功能.
我想解决为何该蛋白质有个有功能, 有的没有.查了很多资料, 一直没有看到先例.可能通
过磷酸化这样的方式来调节吗? 好象也没有办法分离这2种形式的蛋白. 到着里问问蛋白
专家, 有何建议. 有人知道同样的先例吗? 有说个不明白的地方,我再补充. 谢先. |
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w*****t
发帖数: 49 | 33 说几句我的lab manager.他,男的,白人,比较憨厚,
干活比较bt,但是作pcr,酶切,clone从未见过返工.
1.primers设计就不说了----其实这一步是非常重要的.
2.pcr, 一般是20ul试试primer,然后上一排 8 X 50ul 体系. |
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o******d
发帖数: 476 | 34 作这种克隆，最容易碰到的误区就是重细节而忘记最本质的东西，以至于根本无法定位
自己的错误，造成反复无效劳动。
做一个构建，就是一个小的project,过程无非是设定目标，作尝试，检验自己是否达到
目标。其中最重要的是检验自己是否达到目标，而且是一步一步的加以检测。LZ应该做
的是，去看自己的笔记，想想你的每一步都有可靠的结果么？就像问得很多次的问题，
你PCR的结果真的是你要的条带？怎么证明，广一个ladder提供的尺寸够不够？还应该
有什么其它方法。然后你真的装进载体了么？有什么证据，酶切的，测序的，这些结果
是不是可靠，对照有没有。如果这样一步步看下来没问题，那只能说碰到一个做不出的
克隆了，放弃也好，找人帮忙也好，都要理直气壮得多。
做实验做到不顺的时候往往会怀疑自己的每个实验细节是不是有问题，见过有些人最后
怀疑到连移液抢都要重新去校。但最重发现其实是自己在开始就错了，自认为得到的
possitive结果其实是个false possitive |
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y******y
发帖数: 107 | 35 用shirmp alkaline phosphatase 处理过双酶切plasmid A. 不知道为什么colony这么
少。 |
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j*********n
发帖数: 168 | 36 哈哈，LZ真有意思！
您也不说说，您跑得是什么样品啊？
是提取的总DNA，还是PCR产物，还是酶切回收，还是啥别的啊？
能跟marker的位置有一比，那您marker的位置，是多大的片断啊？
您不把这些情况交待清楚，咋帮您判断呀，呵呵。
-5 |
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s*******y
发帖数: 2366 | 37 不了解这个载体，有没有查文献看别人插入最大多大？
可以试着用promega的TSAP (Thermosensitive Alkaline Phosphatase)处理一下单酶切
纯化载体，使其无法self ligate |
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s*******y
发帖数: 2366 | 38 我也觉得没关系
insert大小对ligation影响不大
摩尔比关系也不大。。。
我觉得应该是酶切不彻底
跟你insert多长P关系也没有。。。
唯一的关系就是以后算ligation 摩尔比的时候可以考虑一下 |
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X***n
发帖数: 366 | 39 惭愧。我是postdoc，实验室里就我一个人做分生。
双酶切， SacI和SalI，没有CIP处理。
这种情况下3：1链接过夜没问题吧？
只是想问问版上是否自己的设计本身就不合理。
主要是另外7个小的都出来了，这三个耽搁太久了。有些急。 |
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e****s
发帖数: 1125 | 40 有道理，
我从来不大在乎什么3:1的比例，
一直是能多加Insert就多加点，特别是PCR酶切产物。 |
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e****s
发帖数: 1125 | 41 有道理，
我从来不大在乎什么3:1的比例，
一直是能多加Insert就多加点，特别是PCR酶切产物。 |
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n****e
发帖数: 1677 | 42 用LIC plasmid吧，不用酶切，PCR完直接连。 |
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T****r
发帖数: 4006 | 43 不大，出来的都是空载体说明你vector没有处理好，或者发生了自连，酶切时间长一点
，之后用CIP处理，跑胶速度慢点，跑久一点让分离效果好点.....小地方要注意，处理
的干净整齐，还有看看你competent cell的效率是不是好...这个的影响是很大的.. |
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s*******y
发帖数: 2366 | 44 我也总是先TOPO TA
PCR产物酶切效果总是不好:( |
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O******e
发帖数: 14 | 45 PCR出一段5k genomic DNA，试图克隆进载体。阳性克隆数很低（or 大量假阳性），而
仅有的几个通过clony pcr筛选的克隆，经过酶切或两端测序，发现或者中间缺失，或
者一端缺失，长度在2－3k之间，克隆进去的片段序列正确。Ligation前跑胶确认PCR
insert完整。已困扰3月，请高手解释原因和解决办法。
这段序列含一个基因的3' UTR及之后的大量non-coding genomic DNA，也许克隆后不稳
定？是重组吗？试过几种载体（TA或Blunt）和E.coli，包括Top10，clontech的stellar，还有promega的。
谢谢。 |
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h*******0
发帖数: 14 | 46 正在克隆700bp片段到17kb质粒，试了好久，未果。试过将片段插入到pBlueskript(3kb
),效率很高，估计是载体问题。用一般的Qiagen柱子胶回收不了这个酶切过的质粒,只
好用spin-x,但效率很低，还需要PC8。我估计提高质粒的产量和质量会有助提高连接效
率。轻高手指教一下，谢谢。 |
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J********n
发帖数: 534 | 47 "用一般的Qiagen柱子胶回收不了这个酶切过的质粒"
why?
加1倍体积的isopropanol，就可以了吧。 |
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s******r
发帖数: 2876 | 48 你可以试试低熔点胶。
正在克隆700bp片段到17kb质粒，试了好久，未果。试过将片段插入到pBlueskript(3kb
),效率很高，估计是载体问题。用一般的Qiagen柱子胶回收不了这个酶切过的质粒,只
好用spin-x,但效率很低，还需要PC8。我估计提高质粒的产量和质量会有助提高连接效
率。轻高手指教一下，谢谢。 |
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k********u
发帖数: 2209 | 49 看你的实验设计。如果只是想把质粒整合到基因组里面，一次cross-over，
质粒是插进基因组的。你的示意图，第二步，酶切后的质粒依然呈环状，
与宿主菌上的同源序列配对，然后cross-over。 |
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q*****d
发帖数: 445 | 50 我来回答你：以缺失基因的ORF为例
Chromosome: Promoter ORF Terminator
Plamsid: (Enzyme A) Promoter marker Termintator (Enzyme B)
你的质粒应该是这个上面的第二个结构，用A,B酶切之后，转化就OK了，你设计的结构
是很容易发现回复突变的，但是可以用Marker进行筛选。 |
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