r**a
发帖数: 121 | 1 我觉得联接酶，应该不会有什么问题的，常用的T4，至少我连6000片段到8000载体没有
什么问题。
你看看前面的步骤，酶切位点有没有特殊性，切没有切好（保护碱基啊），我觉得初问
题可能性更大 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 2 1. Crispr载体选择， px330, px335(nickase), px459(puro+), px462(nickase,
puro+)
Nickase的系列在做KO的时候效率会高些，不知道做knock-in mutation哪种效率更高？
你所说的selection marker是crispr载体上带的selection marker(eg.
Puro+), 还是donor上带的selection marker? 我准备用ssDNA做donor, 做点突变的
时候好像也不方便在donor上引入selection marker
**我用的459，主要是要它的puro-selection。这个是筛选transfected cells的。也可
以用带GFP的vector,作cell sorting. 我原文说的selection和这个无关，是指有HDR发
生后的筛选。是，这个selection marker是一个头疼事，我也不太熟悉。
2. 你是在donor 上引入酶切位点（通过silence mutation）, 然后PCR酶切鉴定吗？
*... 阅读全帖 |
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t*****z
发帖数: 1598 | 3 喜欢Fermentas的酶。RE都换成FastDigest格式的，全部缓冲液通用，和其他修饰酶也
可以通用，做什么都不用换缓冲液，而且连loading dye也给你加好了，非常适合我这
种懒人。T4连接酶，号称室温五分钟（我没试过这么短的）。
克隆载体方面Fermentas有个pJET，便宜又好用，传统的平端T4连接，但是效率很高，
我每次只连15-30分钟，就长出很多克隆。阳性率100%，假阳性率0%，我有时甚至都可
以省下筛选这一步，直接养菌抽质粒了。美中不足的是载体上的常见的酶切位点少了点
。与之相比的QIAGEN的pDrive，也挺好用，但是阳性率不是那么高，。每次还是不得不
挑那么四五个菌落来做PCR鉴定。Invitrogen的TOPO TA载体们，我们实验室和隔壁实验
室用起来都很不顺利，我现在弃之不用。
Invitrogen的Gateway载体们，虽然贵，没办法，只能买他们的，感觉Gateway这么方便
的东西还是只此一家。效率不高，有时会出问题，但是勉强够用了。我曾自己试图构建
类似于pDONR的载体，失败，原因复杂，一言难尽。不喜欢NTI，宁可用最土的BioEdit |
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发帖数: 1 | 4 哎，别说跑胶和我师姐了
说起来都是眼泪。
我师姐长得特清纯，对我特好，我特喜欢她。
那天情人节，我学着网上的创意，酶切了一个质粒，跑胶，想跑出一个心形来表达我的
心意。
我估计胶快泡好了，我跟我我师姐说有个特别礼物给她，让她去给我的胶照相就知道了。
结果一会我师姐脸铁青着就回来了，把照片拍在了我桌子上。
我一看，怎么是一个阴茎形状的胶图。
我是百口莫辩啊。
从此以后师姐再也不理我了。
后来她毕业了。
再后来一次学术会议上看到她，还是那么漂亮，那么清纯，旁边站着英俊的丈夫和两个
可爱的小孩。
哎，本来旁边站的该是我啊。
现在我一直怀疑是不是扑克师兄把内切酶给我换掉了。 |
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i****w
发帖数: 38 | 5 看了txsky的帖子，我有些想法:
1. 首先还是要感谢你的那些建议，非常的中肯，我本人也确实像biglizheng说的不够
圆滑，这么多年了一直在改，修行还是不够。但是，我已经在其他的帖子中说了，系里
在我跟台湾老板发生不愉快之前就通知ISO hold住了我DS2019的renew申请（我能肯定
台湾老板参与了，至于印度老板参与与否，我不知道），所以不管当天的不愉快发生与
否，他们总是还会找机会的。而且事件发生的当天，是实验室唯一一个硕士生有课的一
天，他只在每周二上课，你不觉得太巧了吗？
2. 我想强调的是，自始至终我并没有跟台湾老板争吵，但当时实验室只有我们两人，
没有人可以作证。另外，他老婆直接指导我的实验，事无巨细，她是assistant
research professor，我觉得她是我的supervisor，跟她打招呼出门没有什么不可吧？
所以，在最后跟印度老板和台湾老板meeting的那天，我明确指出了这两条指控是不正
确的，是荒谬的，当时台湾老板一句话没有说。
3. 他做科研我是一直很佩服的，我在加入他们实验室的时候就说这也是我做决定的因
素之一，甚至就在最后meet... 阅读全帖 |
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t****3
发帖数: 6964 | 6 提问: 用EcorI 来限制性内切博导14寸内的DNA, 需要2小时内完成酶切，在最适条件下
需要多少酶来参与反应？ |
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R*****o
发帖数: 14902 | 7 【 以下文字转载自 Love 讨论区 】
发信人: zhangyustc (??), 信区: Love
标 题: 正能量贴~大家说说生命中的心动吧！
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Aug 5 19:35:43 2014, 美东)
我先说，虽然时间久远，对当事人也毫无赶脚了。。。但是心动的感觉记忆犹新。。。
我在生物实验室，放酶切菌液在冰箱过夜，师兄带手套的手扶我带手套的手扶着酶切菌
液放进冰箱。。。 |
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z********c
发帖数: 1268 | 8 我先说，虽然时间久远，对当事人也毫无赶脚了。。。但是心动的感觉记忆犹新。。。
我在生物实验室，放酶切菌液在冰箱过夜，师兄带手套的手扶我带手套的手扶着酶切菌
液放进冰箱。。。 |
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s********s
发帖数: 84 | 10 测基本上是，是把得到的virus稀释后 infect细胞 然后用抗生素blasticidin 选出来
有抗性的以后 染色 数有多少colony。
载体重组了。。如果是这个原因 有啥办法呢。。只能换载体么。。
to neverthink 更多的细节啊
是用PENTR3C （里面有表达目标蛋白的gene）
然后和 plenti6/V5-DEST 做LR recombination
得到colony做酶切 看看位点之类的对不对
最后得到plasmid （用来做transfection之类的能得到蛋白表达）
用这个plasmind然后和pLP1, pLP2, pLP/VSVG之类的一起transfection 293T 细胞
得到virus
然后infection 然后检测蛋白没有。。
曾经用同样的办法做了几批virus，曾经有一批是能检测出来的。
但是后来我再做就不行了= =
反反复复几次以后 老板就让我重做一遍vector 就是从PENTR3C和自己目标蛋白gene 酶
切，ligation那步开始重做。也不说为啥要这样。一摸一样的方法重做一遍会有啥改变
么。。
PENTR3C这个原始的载 |
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x**2
发帖数: 255 | 11 谢谢回复～
我的片段1确实是在TOPO里，
我的正向primer含EcoR1位点和6个保护碱基，反向pcr primer含Nhe1和6个保护碱基。扩出的片段末端加A后连到TOPO上。
这样会有问题么？
或者我把片段1前面的酶切位点改成BssHII？这样就和片段4的酶切位点一样了。
谢谢～ |
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T**********t
发帖数: 1604 | 12 看起来你突变后挑菌落做的miniprep量是没问题的，可是size好像差太多了。而且双酶切只有两个酶切位点，和突变之前的质粒差别太大了。我觉得是质粒出错了，会不会转化的时候污染了其他质粒，挑错了菌落。如果miniprep出来的质粒是错的，还用原来的测序引物去测，因为引物不对，当然就测不出来了。
看了一下前面的回复，4楼的同学早就言简意赅的说过了。 |
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M****m
发帖数: 2142 | 13 酶切后我的gene 是3.3 vector是 3.4，该怎么跑胶才能把他俩分开我好回收我的片断
？我用的PcR-XL-TOPO，vector其他区域有没有可以被酶切的这样vector size变小就可
以回收我的片断了？或者跑0.5%的DNA gel跑远些 可行吗？ |
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b******r
发帖数: 111 | 14 Good idea. My 9kb DNA itself contains too many restriction sites. NotI is
the only choice.
'Description:
Important: GeneHogs® competent cells are being discontinued on December
31, 2007.
Use ElectroMAX™ DH10B™ T1R cells for exceptional performance!
'
常做的克隆比是不是还比较正常，如
果比较正常，那说明这种假阳性很可能是因为你的插入片段有一段序列比较容易发生重
组，试着30度长克隆和摇菌看看。
另外，能不用单酶切做克隆就不要用，你大片段克隆还用这个策略，最好换其它双酶切。
这个菌株，从来没出现过问题，感
受态效率一般7次方就可以了，15kb可以长百来个克隆。
发生重组的质粒，一般10个有2个
总是对的。 |
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y******y
发帖数: 107 | 15 就是一个单链的plasmid，请问什么酶可以切除，而不能切双链的plasmid。
Mung Bean Nuclease？
T4 DNA polymerase？
谢谢。 |
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l*****i
发帖数: 1163 | 16 紧挨着测序引物的下游会有一段没有测序结果，或者结果不可信。不知道你的测序结果
里面是否可以看到TOPO II的部分序
列。
我在国内的时候碰到过引物上的酶切位点有错误。还有你说的酶切位点不完全是什么意
思？不能切开还是不能完全切开？ |
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g******1
发帖数: 244 | 17 不需要线性化，直接在两头引物加两个位点，PCR以后双酶切，或者末端填平磷酸化自
连转化扩增后再双酶切。LA-taq突变率挺高的，建议phusion。 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 18 2 个碱基保护未必够
我记得有个表格是说常用限制性内切酶分别需要几个碱基保护、酶切效率是多少
表格不在手边
不过你可以网上搜一下
另外也有可能像我上次遇到的，引物5'端合成的时候就少了
但是看你的描述我觉得更有可能的就是ligation不work
因为某些原因平板张长的都是false positive
ligation之后长满满的一般真不是好事 |
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d****i
发帖数: 2346 | 19 测序后发现只有上游的酶切位点保留，不明插入片段下游的酶切位点都消失了。
很郁闷！ |
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Z******5
发帖数: 435 | 20 把链接之前的PCR产物测序一下，看看对不对。
此外，在目的基因内部找一个或两个常用的酶切位点，在PCR之后和克隆测序之前酶切
看看条带大小对不对，也可以作为初步判断的依据。 |
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C***N
发帖数: 200 | 21 哪里可以查到编码限制性内切酶 cDNA 序列？打算AluI转到细胞里，切割多次重复的
AluI。大包子求助。 Thank you |
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S*****s
发帖数: 287 | 22 Nucleotide sequence analysis of DNA. 28. Arthrobacter luteus restriction
endonuclease recognition sequence and its cleavage map of SV40 DNA
http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/bi00661a032
用了这么久的内切酶从来没考虑过它的具体序列是什么，看到你的帖子出于好奇找了一
下，这是我找到的一篇文章。我在家没办法看内容，不过希望对你有用。 |
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C***N
发帖数: 200 | 23 载体的酶切位点是否是甲基化敏感的？建议在dam-的E coli里提载体，再酶切，连接。
DE3
（2 |
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H****s
发帖数: 301 | 24 有两个建议：
（1）改双酶切连接为单酶切连接。载体要处理好。
（2）使用DH10B感受态。或者是类似的RecA-菌。
我做的插11kb到5kb的载体上去，基本上都成了。 |
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b****r
发帖数: 17995 | 25 你的意思是，双酶切载体和插入片段，互补端对T4活性有影响？
不过我以前做单酶切然后去磷酸化，结果无数自连没一个连进去了的，这个怎么搞呢 |
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H****H
发帖数: 11039 | 26 不是很复杂的事情啊，折腾这么久真有点说不过去了。照你说的“BamH1和Hind3在8里
面中间就隔了1个碱基”，你这酶切就做不好，切开一个位点，另一个位点切割效率就
很低。许多酶需要“保护碱基”才能切得开呀！
以后别闷着头瞎做了，遇到麻烦多查查资料或者请教一下周围有经验的同事，也许很快
就发现问题了。 |
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y***i
发帖数: 11639 | 27 定一对probe改造一下就可以了。
比如 pQE70酶切位点是 EcoRI-BamH1-Hind3. 你可以定一组probe，anneal后两边分
别是EcoRI 和 Hind3的位点，中间有BamH1但是和HindIII用4 5个bp隔开。然后把
construct用EcoRI 和 Hind3酶切--连接，以后用就很方便。 |
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h**********r
发帖数: 671 | 28 以前好好的。接着几次跑胶小片段都有点弥散，不知道原因。左图是筛克隆时的双酶切
，质粒是按《分子克隆》的碱裂解法提的。右图借用别的lab的qiagen的试剂盒提的然
后双酶切。问题也可能出在loading dye上。按《分子克隆》配的6X,40% sucrose加上
两种染料。EB是直接加在胶里的。大家看看吧，多谢！ |
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c****1
发帖数: 1095 | 29 DNA marker不是很便宜，实验室用量很大（小分子量的），老板不肯花钱买，让我们自
己做。老板
提的方法是，用PCR，扩不同大小的产物，然后混在一起。我觉得，自己改装一个质粒
，然后用一个
单一的酶来切，得到不同大小的片段。质粒容易量产，酶切也容易，我想那些公司应该
用的就是这个
办法。不知到哪里可以买到这样已经改装好的质粒。有没有哪位同仁愿意share？ |
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b******s
发帖数: 1089 | 30 本来容易的gateway cloning成了最近几个月摧毁我身心健康的罪魁祸首。
哎，说来话长。先来介绍背景：1年前开始用gateway做克隆。在此之前实验室也一直用
gateway，但是实验室很小，我之前只有一个日本博后。做了好几年。几乎所有的东西
都是从他那里来。我们用的是multisite gateway，细说就是三个entry clone和载体一
起连。
我做了N次（我都不好意思说N等于多少了），一个确定的都没成功。
症状：每次连接之后转e coli都有菌落，而且菌落看起来正常。介入液体摇也正常生长
（spectinomycin resistance）。但是colony PCR有时会有不浓的bands，size貌似正
确，但是很多时候PCR失败。提plasmid PCR也失败，酶切也失败。
可能一：entry clone有问题。用gateway做entry clone很容易，应该不会，我做了好
几个entry clone，都sequence过，PCR检测等很正常。
可能二：我哪里做错了。至少我现在想起来应该没有。我经过无数次改进，从反应DNA
浓度到反应时间到heat shoc... 阅读全帖 |
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T*****n
发帖数: 274 | 31 简单啊，克隆进去不就行了。在那段丢失序列附近找特异性酶切位点，PCR克隆。
不想做酶切连接的话overlapping PCR应该也行，视质粒大小。 |
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b******n
发帖数: 4225 | 32 呵呵，那可以这样，先BamHI单酶切连接PCR产物的一部分
（外面的BamHI位点设计成BglII）
然后再MluI和BamHI双酶切连接PCR产物的另外一部分
PCR产物 MluI-BamHI-BglII
先克隆BamHI-BglII片段进入BamHI消化的载体
得到正确克隆之后再克隆MluI-BamHI进去
这个缺点就是没法转移到另外一个载体上去了 |
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S******l
发帖数: 14311 | 33 可以直接用Mlu----BgII 策略（BglII和BamHI是同尾酶）。考虑到将来可以切下来，还
可以在BglII内侧加其他酶切位点。 |
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i*****g
发帖数: 11893 | 34 很有意思，看见这么多人在说这个想法。
这个想法我在2005年1月之前，换实验室时，和PI说了，他听不懂这张PPT意味什么。
后来我又换了实验室，2007年（2008？）某天新老板和我听完某个不相关的seminar，
和我说起这个，他才开口说了2句，我就知道他想说什么，
他的反应是，i have not finished my briefing yet, you really understand my
point? 于是就和他说，of course i know what you want to do,然后讨论了半天，原
来他的朋友有这个想法 etc etc，后来我又做了一些Homework，还是决定放弃。这个很
不好做，估计是个死途。
这个技术最大意义是：能找到locus specific DNA-protein complexes。目前的通行做
法是，已知某个protein, 你用CHIP，证明在某个Locus上面，然后开始making story，
编剧。但其实，那个Locus上面可能有几十种特殊蛋白在调控！！！
2004年底，我的想法来源于推广TAP+MS，我已知 TAP+MS... 阅读全帖 |
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l*****m
发帖数: 98 | 35 RT-PCR后酶切,产物2.3kb,跑胶后提纯,浓度很低(5ng/ul).载体酶切,跑胶后提纯(15ng/
ul).连接一个小时,转化.有两个菌.其中一个菌不对.另外一个有一个突变.pcr产物测序
没有问题.请问怎么解决?谢谢. |
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o*****r
发帖数: 156 | 36 Yes.
另外，primer设计的时候，两边的酶切位点旁边都要多放几个，这样酶切效率会高一些
。 我通常两边都加8个（atcgatcg） |
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j****x
发帖数: 1704 | 37 设计好酶切位点几个片段丢一起直接连接就行了，和普通连接一样没啥可讲究的，关键
是处理好每个PCR产物，酶切要尽可能彻底。
实在不行就一个片段一个片段的连接，其实相比起来也耽误不了几天时间 |
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a******p
发帖数: 414 | 38 17k还用酶切，还是单酶切？ 真牛呀。 用重组吧 |
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h******y
发帖数: 55 | 39 在插入位点两侧找合适的酶切位点，然后合成有相同位点的带有30bp插入片段的序列，
直接置换就可以。能找到合适的酶切位点就可以。
大片段backebone连接可以用胶连接。我们做过30多k的。
有没有包子？还没有收过包子呢！ |
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r*****5
发帖数: 1876 | 40 以前没有做过这方面的，特像大家请教，谢过了 ：）
跟别人要了个他自己建的载体， 没有全部序列，只有酶切位点那部分的序列， 我也不
知道转录起始点在哪？ 我想做的是： 把我的蛋白CDNA 序列从起始密码到终止密码拷
贝过来， 再在CDNA 序列前加上KOZAC 序列， 最后在两端加上酶切位点和保护性碱基
就好了？ 这样对么？
可是怎么样才能保证没有移码呢？ 请各位指教啊？
我要用此质粒做转基因老鼠，已经费掉１万块了，如果再不成功，就惨了， 谢谢各位
。 |
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f**u
发帖数: 346 | 41 原核的SD序列和ATG间的距离很重要，所以经常ATG必须插在某个酶切位点。
真核的Kozak本身包含ATG，所以用什么酶切无所谓了。
另外真核通常认为Kozak不是必需的，但是加上不会有坏处。
还有就是我记得ATG后面的G据说很重要。 |
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b******s
发帖数: 1089 | 42 实验室其他人遇到过经年的KpnI不work。但我自己切没遇到过问题。单酶切你可以上很
浓的质粒，多加点酶，但是不要超过反应体系的10%，过夜，加CIP，应该能做出来。
fragments
ligation |
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j******n
发帖数: 941 | 43 用的Origene pCMV6-Entry的骨架
发现这个骨架本身用Zymo的z competent转化效率就特别低 怀疑是低拷贝质粒
5ul质粒+50ulcompetent也只能长出十来个克隆
可是用这个骨架酶切后与目的基因PCR酶切产物做T4连接后更死活长不出克隆来
请问大家有啥建议？换competent？哪个公司的DH5a转化效率更好些？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 44 要再克隆会非常麻烦，因为需要把promoter 和poly-A tail 都克隆进去，一方面是会
非常
大,另外一方面是可能会找不到任何合适的酶切位置（因为promoter 和poly-A tail 外
围的酶切位置本来就不多，就算有也很可能正好在我们的fusion protein 上同时也有
切点，另外还要看是否和piggybac里面的克隆位置compatible，实在是不看好。
我更感兴趣的是：如果我的质粒不在那个piggay vector 上，光是表达helper
transposase，
能否增进我的那个质粒的随机插入几率？ |
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j*****q
发帖数: 82 | 45 图在这里的说。。。
lane1 是没有酶切的negative control，
lane2是酶切的结果，上下两条带的位置是对的。 |
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j*****q
发帖数: 82 | 46 小弟又来汇报个新问题，按照ls几位的指点，注意了lysis的时间，现在发现还是有一
条酶无法切开的带。在circular plasmid也有这条带，但是跟lysis过程中的那条带位
置不一样，看着象是supercoil，但是为什么切不开呢？
见图
lane6和7是不同的酶切的，8是plasmid control |
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t**********8
发帖数: 223 | 47 准备做4c了，看着protocol挺简单的，就是酶切，ligation，再酶切，再ligation，但
听说很难做成功，难道有什么trick吗？有做过的能不能谈点经验和教训？
这个实验麻烦的是，感觉挺难control，一轮做下来要一两周，直到测序，除非拿到想
要的结果，否则你怎么知道中途有没有问题呢？我研究了一下，觉得3c的ligation可能
比较关键，是不是要严格控制dna的浓度和ligation的时间啊？
多谢了！ |
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m******5
发帖数: 1383 | 48 我的意思是楼主不用担心loxp丢掉，至于能不能用是另外一回事
一听到自己不用做老鼠的就妒忌得不行……做construct打ES再等germline
transmission 最后等表达等phenotype多折腾人啊！！！
设计那么多酶切位点太夸张了，我觉得只要PCR sequence一下就可以了
800 bp那个floxed region他们设计酶切位点是precautions?最后有发现只有一个loxp
的克隆么？我看文献里报道了这种情况的都是2k floxed region才发生的。 如果800
bp能发生岂不是说明short arm只要800bp就能做targeting? (当然也可能，不过300bp
我觉得如果发生了可以发个genesis报告了)
http://www.currentprotocols.com/WileyCDA/CPUnit/refId-mo100159.
鼠女王能帮忙下载一个paper么？ |
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s********n
发帖数: 2939 | 49 设计primer带有你要的酶切位点（能够使你的5‘伸出来），PCR扩增后再酶切 |
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w*e
发帖数: 740 | 50 未酶切的因为是环状，所以没直线的单酶切跑的快，和结构有关吧 |
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