s******s
发帖数: 13035 | 1 crispr确实很牛，不过多伟大倒不一定。没了crispr也有zfn和talen,
以后也有drispr，这个和ips的原创性和亮瞎狗眼性完全不是一个档次的 |
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T*****e
发帖数: 247 | 2 你说的也很好！
我感觉有一种趋势，随机的插入的情形可能会越来越少。
两个原因：
1.随机插入有时候真不好说，可能会破坏不相关的基因功能，当然前辈们也正利用了这
一点。
2.老一点的BAC，以及最近CRISPR，TALEN这些新技术出现后，大家都想精确操控
transgene，一来好定量比较，二来省去很多不相关的来回论证transgene的实验。
我这里默认就是定点插入的。至于插入到哪个位点最高，虽然也有人比较过。但是我不
认为已有定论。 |
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s********x
发帖数: 472 | 3 zhang无疑是努力成才的典型。其实从他的optogenetic，到talen 到crispr，都既不是
他原创的idea 也不是他原创的方法。但是他在这么激烈竞争的领域里胜出，除了运气
以外，显然自己的hard working是很了不起的。其实谁都能想到的东西，能够抢先就是
手快。
我倒是可以期待一下zhang到会在那方面有自己独特的贡献。 |
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x********e
发帖数: 35261 | 4 直接做genomic PCR啊
如果是random mutation的话我知道有人用realtime pcr去screen TALEN mutant
如果是有target的话，比如CRISPR，我身边也有人直接设计target site的primer，然后
普通pcr就筛出来了
听听其他有经验的同学怎么说 |
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c*****u
发帖数: 439 | 5 张的工作一直都很系统，并且好用吧。 之前他们也有一个talen 的论坛 和现在的
CRISPR 一样。
张和church 还有standford的那个哥们都是跟风。 最后给到谁不知道了就。 |
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b******k
发帖数: 2321 | 6 你非要扯也有 Roger Tsien曾经还插了一脚 哈哈哈
张峰还是靠Cas9吧 不过这个估计要看到临床意义才有戏 否则的话还要和ZFN和TALEN去抢
另外听rumor说cas9张峰是抢了他老板Church的 不知道真的假的。。 |
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j****n
发帖数: 3370 | 7 如果ZFN TALEN CRISPR分享炸药奖的话 zhang feng估计没戏吧
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7 |
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m*p
发帖数: 226 | 9 "DIY"是什么啊？
我也可以用传统的方法做knockin， 但是花费大概2万8千。用传统方法但是更便宜的公
司也可以考虑。 谁有相关的信息吗？谢谢！ |
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b******9
发帖数: 102 | 10 自己动手啊，又不是很难，addgene有现成的质粒，买来直接用，只要自己构个donor就
行了。 |
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m*p
发帖数: 226 | 12 It is not as easy as you said. You need to do super ovulation ,
microinjection, and put the embryos to pseudo pregnant female via surgery,
etc.. 若是成批的生产老鼠可以考虑，就造几只老鼠，不值得。
还是要问，谁有相关的knockin 公司的信息吗？ 谢谢先！ |
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b****r
发帖数: 17995 | 13 这种东西如果老板不是实在穷我认为不应该花自己时间做。自己应该做那种没法外包的
探索性的，独特的东西 |
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b******9
发帖数: 102 | 14 你要做小鼠啊，国内的可以试试百奥赛图，他们这方面比较擅长。 |
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m*p
发帖数: 226 | 15 谢谢biows119, 我准备更他们联系了解一下。 |
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s***a
发帖数: 43 | 16 【 以下文字转载自 Faculty 讨论区 】
发信人: SWJSJ (BC), 信区: Faculty
标 题: 调研了一下清华最近回去的PI
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Dec 15 16:27:25 2014, 美东)
云老师发了个贴说清华目前的找人标准，很多人不相信。特地调研了一下清华生命学院
最近回去的人的情况，如云老师所说，绝大多数都有2cns，如果只有一篇cns，那基本
上还有>2的子刊。这个不仅仅局限于胖老师经常说的结构生物学，而是所有方向都基本
如此。
当然这些新回去的绝大部分都是千青（有些不是的是因为回去那一年千青还没开始）。
网页上的Title有的是教授，有的是研究员，估计当时还没有统一。但校内一律都是副
教授，也就是相当于这边的AP。我还特地打听了一下，国内的TT制度好像没有Tenured
Associate这一档，清华5年考核通过了就是正经的full professor。
有些老师看不上国内的科研，我就仅列出两位回国后的publication，咱就不说颜宁等
这种Early T的个例了。说两个没太有名气的，还没有评上T的，各位老师可以参考一下
，... 阅读全帖 |
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j******i
发帖数: 939 | 18 ZFN, TALEN, CRISPR对使用者来说是个技术，对开发者来说是个领域，所以他们能持续
不断的推进这些技术。这些技术有巨大的商业价值且都已经被专利了。国内的公司把他
们商业化的话会有专利问题，因此，基本上没法卖到国际上。 |
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m****a
发帖数: 270 | 19 感觉Feng Zhang就是个做技术的工匠，不管是开始的optogenetics，还是后来的TALEN
，最近的CRISPR，他都是在改进和实现技术。即使拿不了诺贝尔，他还是做出了非常大
的贡献的。 |
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m****a
发帖数: 270 | 20 感觉Feng Zhang就是个做技术的工匠，不管是开始的optogenetics，还是后来的TALEN
，最近的CRISPR，他都是在改进和实现技术。即使拿不了诺贝尔，他还是做出了非常大
的贡献的。 |
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V******t
发帖数: 444 | 21 比如实验需要NIH3T3敲除某基因，能否用老鼠胚胎干细胞打靶的原理，做基因敲除呢？
怎么很少看到有人做这样的事情呢？ |
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j****n
发帖数: 3370 | 22 效率太低吧
一般低于1/1000，有的低于百万分之一
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7 |
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r******g
发帖数: 600 | 24 见过crispr KO cell line的
貌似不难做～ 不过没有深研究
不知道怎么解决off target的问题了... 并且，貌似没有很好的control
老鼠身上的off target在breeding的过程中，自动dilute out了 |
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w***r
发帖数: 709 | 25 大多数细胞系同源重组率非常非常低。ES细胞同源重组比较高。
可能和细胞dna修复的machinary有关。nhej 比较强,等等。
不同的转染方法也影响重组率，比如ES,普通转染的重组效率远低于电转
另外细胞系,比如 3t3,都是多倍体，而且没办法通过交配形成KO。
有rnai,很多时候没必要做Ko. |
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s******y
发帖数: 28562 | 27 效率太低。别忘了染色体有两个。敲掉其中一个的几率大概是百万之一，敲掉两个的个
概率就更低了。要筛选很多细胞才能筛到一两个。
对于胚胎法，其实是先敲掉一个拷贝，然后弄成老鼠之后再交配一下弄出个纯合体来。 |
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s********r
发帖数: 312 | 28 关键是要把DNA搞断，之前在mES里做gene-targeting，要用很长很长的homology arm,
才有很低很低的概率正好在那个地方发生同源重组。现在可以先把DNA在那里先搞断，
同源重组的概率就高了上千倍 |
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n**8
发帖数: 221 | 29 做细胞line的比较少。
能拿到hom的概率低，另外,这些细胞系养了那么久了，核型估计都不太正常了。 |
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j****n
发帖数: 3370 | 30 那生物老博真的搬砖不如了。。。
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7 |
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r******g
发帖数: 600 | 32 293T 不是有10-20%么？
是Church的paper里面么，有写啊
直接做CRISPR以后，然后 理论上做单细胞克隆，筛就能筛出来吧
只不过有点儿laborious
难道我理解错了？
我自己没做过，但是仔细研究过做过的protocol，nucleotide-to-nucleotide的比较
之前有个哥们人回帖说，homology arm要很长的，crispr的DNA oligo的homology arm
不需要很长 |
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x********e
发帖数: 35261 | 34 药筛很简单吧？能活下来就是重组了的。不过sunnyday说的allele问题是关键，无解。 |
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r******g
发帖数: 600 | 35 我完全混乱了
楼主说的这种情况，为什么需要药筛呢？
直接把 在 exon 或者 exon junction的 DNA double strand 用Cas9 break了，NHEJ不
就把target gene给敲了么
然后做单细胞克隆，然后再PCR筛，sequencing confirm，难道这样不是简单些么？ |
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r******g
发帖数: 600 | 36 你说的是把一个药筛的cassete knock in 到target gene locus里面去么？ 还是直接
用homologous recombination的办法，把基因替换？
这个用crispr难度很大的～
几十个nucleotides，比如一个loxp site之类的用crispr可以knock in，东西大了弄不
进去的... |
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r******g
发帖数: 600 | 37 http://pnabio.com/products/KOCells.htm
你们看
Cell lines that we have generated knock-outs or knock-ins
HEK293 cells
HeLa cells (hypertriploid)
SKBR3 cells (hypertriploid)
HCT116 cells (diploid)
MCF7 cells (Hypotriploid)
K562 cells (hypotriploid)
CHO cells
NIH3T3 cells
We have successfully generated knock-out clones up to 4 copies in one round.
应该不难做吧
成功率应该不低，好想自己试一下 |
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s******y
发帖数: 28562 | 38 你过奖了，另外几个人（比方说whour）也指出了同样的问题。 |
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x********e
发帖数: 35261 | 39 这楼说的是CRISPR出现之前用同源重组做细胞系KO啊, 看标题 |
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r******g
发帖数: 600 | 41 不好意思啊....
题目都没看清楚...
recombination rate太低了，搞不定的 |
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r******g
发帖数: 600 | 43 药筛 筛出来都是single allele
要找both alleles的recombination 就很难啊 |
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x********e
发帖数: 35261 | 44 不管single还是double都是用筛的啊
不知道可不可以提高药的dose来筛allele |
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x********e
发帖数: 35261 | 45 为什么ES cell可以筛？是因为ES cell里同源重组概率大于random integration? |
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r******g
发帖数: 600 | 46 ES细胞 recombination rate很高啊
做KO老鼠的时候，药筛不是同时positive selection然后negative selection么？ 这
样，理论上说random integration就被筛掉了啊
至于是不是有可能药筛不complete, KO老鼠里面会不会同时也有inregration，我觉得
是有可能的... 并且founder mice PCR一般发现不了random integration
但是这个事情无所谓啊
你就算有random integration，只要不是在target locus的同一条chromosome上面
你反复breed的过程中，random integration就被breed out了
最后还是只有KO target gene是specific |
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s******r
发帖数: 1245 | 47 mES是特例，天生的整体效率比较高，其他细胞就会差非常多
做这个就是拼概率，挑出来的要么是同源的，要么是随机插入。两者之间比例能达到1
比几十几百的还能拼一下，几千几万以上的靠人力是不行的，差一两个数量级就会是能
做与不能做的区别。定点产生DNA break的新技术对同源重组效率的提升是上数量级的
，即便用了新技术随机插入还是占大部分的，但起码现在用人肉能拼一下了 |
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x********e
发帖数: 35261 | 48 不能简便筛同源vs随机的确是目前最大的问题
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c*******e
发帖数: 5818 | 49 有一个allele，我们做了TALEN，因为没有合适的限制性酶，用了T7, T7 indicate 可
能有“indel"，我的问题是，如何确认这个”indel"，不知直接deep sequence之类可
以不，不太想做PCR TA clone，然后做regular sequence。谢谢。 |
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h****n
发帖数: 333 | 50 同意，TALEN完全没必要用deep sequencing的方法确认indel，就普通的PCR条带直接
sanger测序然后分析足够了
序列分析用MutationSurveyor也可以看indel
deep sequencing不止是有钱任性，看indel还不如普通的sanger测序准确，何苦 |
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