T*****e
发帖数: 247 | 1 又到周末了，大家也许有点闲暇。版上讨论用果蝇做研究的不是很多，我在这里抛砖引
玉，挑战一下大家。
第一次挑战的题目：如何设计果蝇中的最强荧光报告基因？
简单的背景：
果蝇作为重要的模式生物，个体小，生长周期短，易于饲养，易于观察，染色体数目少
，能吃能睡能学习，各种研究都可以用它。种种优点让果蝇成为重要的生物学研究模型
。对研究人员来说，果蝇同时具备的一大优势是，有数不清的遗传学研究工具可以用。
就算你自己生造一种，也并不费时费力。这两年特别火的CRISPR更是把这一点推向了高
潮。那么，最常见的一种研究手段就是用一些人为设计的转基因工具，操控果蝇的基因
表达，从而改变某些细胞中的基因功能。以过表达为例，一个简单地UAS驱动的转基因
，加上时间空间特异性的Gal4 line，就可以非常容易的实现超高的表达量。为了防止
某些同学说太高的表达会杀死细胞，我这里限定只能使用荧光蛋白。因为是外源性的，
一般不大会干扰正常的细胞生理功能。
挑战的方法很简单，我在这里写一个UAS驱动的报告基因，如果你觉得其中哪个部分有
提高的空间，能够让这个转基因的表达量提高，就算挑战成功。
为了不放水，我先写一个我认为的一般强的转基因。如果没有人应答的话，我会在稍后
贴出我认为的最强的设计，包括理由和参考文献。
10X UAS + Hsp70 TATA box (basal promoter) + IVS + eGFP + SV40(3'UTR) |
x********e
发帖数: 35261 | 2 搞那么强做什么呢？
就算gfp没有细胞毒性，高表达会deplete转录翻译一系列的调控因子，照样会有影响
【在 T*****e 的大作中提到】
: 又到周末了，大家也许有点闲暇。版上讨论用果蝇做研究的不是很多，我在这里抛砖引
: 玉，挑战一下大家。
: 第一次挑战的题目：如何设计果蝇中的最强荧光报告基因？
: 简单的背景：
: 果蝇作为重要的模式生物，个体小，生长周期短，易于饲养，易于观察，染色体数目少
: ，能吃能睡能学习，各种研究都可以用它。种种优点让果蝇成为重要的生物学研究模型
: 。对研究人员来说，果蝇同时具备的一大优势是，有数不清的遗传学研究工具可以用。
: 就算你自己生造一种，也并不费时费力。这两年特别火的CRISPR更是把这一点推向了高
: 潮。那么，最常见的一种研究手段就是用一些人为设计的转基因工具，操控果蝇的基因
: 表达，从而改变某些细胞中的基因功能。以过表达为例，一个简单地UAS驱动的转基因
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x********e
发帖数: 35261 | 3 另外一个问题是，强UAS能否保证没有leaky expression
【在 T*****e 的大作中提到】
: 又到周末了，大家也许有点闲暇。版上讨论用果蝇做研究的不是很多，我在这里抛砖引
: 玉，挑战一下大家。
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: 简单的背景：
: 果蝇作为重要的模式生物，个体小，生长周期短，易于饲养，易于观察，染色体数目少
: ，能吃能睡能学习，各种研究都可以用它。种种优点让果蝇成为重要的生物学研究模型
: 。对研究人员来说，果蝇同时具备的一大优势是，有数不清的遗传学研究工具可以用。
: 就算你自己生造一种，也并不费时费力。这两年特别火的CRISPR更是把这一点推向了高
: 潮。那么，最常见的一种研究手段就是用一些人为设计的转基因工具，操控果蝇的基因
: 表达，从而改变某些细胞中的基因功能。以过表达为例，一个简单地UAS驱动的转基因
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s********o
发帖数: 91 | 4 这个和chromosome上insertion的位置也有关系吧，我们lab做过定点(attp/attb)的和
非定点的，定点的表达高至少四倍。insulator应该也有帮助
【在 T*****e 的大作中提到】
: 又到周末了，大家也许有点闲暇。版上讨论用果蝇做研究的不是很多，我在这里抛砖引
: 玉，挑战一下大家。
: 第一次挑战的题目：如何设计果蝇中的最强荧光报告基因？
: 简单的背景：
: 果蝇作为重要的模式生物，个体小，生长周期短，易于饲养，易于观察，染色体数目少
: ，能吃能睡能学习，各种研究都可以用它。种种优点让果蝇成为重要的生物学研究模型
: 。对研究人员来说，果蝇同时具备的一大优势是，有数不清的遗传学研究工具可以用。
: 就算你自己生造一种，也并不费时费力。这两年特别火的CRISPR更是把这一点推向了高
: 潮。那么，最常见的一种研究手段就是用一些人为设计的转基因工具，操控果蝇的基因
: 表达，从而改变某些细胞中的基因功能。以过表达为例，一个简单地UAS驱动的转基因
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T*****e
发帖数: 247 | 5 说得好！太强当然可能是有问题的。
姑且不论现在一般并没有半强/强/特强的过表达选择，如果有的话，应该是很有意思的
一件事。
仅就你说的太强的观点，我举个例子。
为了标记神经细胞，很多时候大家会用分布在细胞膜上的荧光蛋白，比如mCD8：：GFP。
行业内现在就有一种认识，认为过多的表达这个，对神经细胞的功能可能是有影响的。
而且如果在共用同一个Gal4的情形下，某一个UAS transgene太强，比如40X UAS-CD8：
：GFP可能会因为占用太多的Gal4影响别的transgene表达。
我这个挑战当然不考虑这些因素。主要的原因是实际情况中，有时候Gal4的表达很弱，
又或者不是Gal4-UAS系统，是直接测试enhancer。那么你确实需要一个有很强表达的
transgene。
【在 x********e 的大作中提到】
: 另外一个问题是，强UAS能否保证没有leaky expression
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T*****e
发帖数: 247 | 6 你说的也很好！
我感觉有一种趋势，随机的插入的情形可能会越来越少。
两个原因：
1.随机插入有时候真不好说，可能会破坏不相关的基因功能，当然前辈们也正利用了这
一点。
2.老一点的BAC，以及最近CRISPR，TALEN这些新技术出现后，大家都想精确操控
transgene，一来好定量比较，二来省去很多不相关的来回论证transgene的实验。
我这里默认就是定点插入的。至于插入到哪个位点最高，虽然也有人比较过。但是我不
认为已有定论。
【在 s********o 的大作中提到】
: 这个和chromosome上insertion的位置也有关系吧，我们lab做过定点(attp/attb)的和
: 非定点的，定点的表达高至少四倍。insulator应该也有帮助
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x********e
发帖数: 35261 | 7 那leaky expression的concern就更重要了
hsp算比较强的promoter了，另外Janelia farm用的是一个果蝇的synthetic promoter,
要稍微弱些，但表达更忠实于enhancer的控制
在UAS element上放大信号我不认为是个明智的方法。
GFP。
【在 T*****e 的大作中提到】
: 说得好！太强当然可能是有问题的。
: 姑且不论现在一般并没有半强/强/特强的过表达选择，如果有的话，应该是很有意思的
: 一件事。
: 仅就你说的太强的观点，我举个例子。
: 为了标记神经细胞，很多时候大家会用分布在细胞膜上的荧光蛋白，比如mCD8：：GFP。
: 行业内现在就有一种认识，认为过多的表达这个，对神经细胞的功能可能是有影响的。
: 而且如果在共用同一个Gal4的情形下，某一个UAS transgene太强，比如40X UAS-CD8：
: ：GFP可能会因为占用太多的Gal4影响别的transgene表达。
: 我这个挑战当然不考虑这些因素。主要的原因是实际情况中，有时候Gal4的表达很弱，
: 又或者不是Gal4-UAS系统，是直接测试enhancer。那么你确实需要一个有很强表达的
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s*****w
发帖数: 27 | 8 http://www.genetics.org/content/186/2/735.full.pdf
【在 T*****e 的大作中提到】
: 又到周末了，大家也许有点闲暇。版上讨论用果蝇做研究的不是很多，我在这里抛砖引
: 玉，挑战一下大家。
: 第一次挑战的题目：如何设计果蝇中的最强荧光报告基因？
: 简单的背景：
: 果蝇作为重要的模式生物，个体小，生长周期短，易于饲养，易于观察，染色体数目少
: ，能吃能睡能学习，各种研究都可以用它。种种优点让果蝇成为重要的生物学研究模型
: 。对研究人员来说，果蝇同时具备的一大优势是，有数不清的遗传学研究工具可以用。
: 就算你自己生造一种，也并不费时费力。这两年特别火的CRISPR更是把这一点推向了高
: 潮。那么，最常见的一种研究手段就是用一些人为设计的转基因工具，操控果蝇的基因
: 表达，从而改变某些细胞中的基因功能。以过表达为例，一个简单地UAS驱动的转基因
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f*******g
发帖数: 245 | 9 UAS-gal 会引出额外的phenotype. 不能再强了。
【在 T*****e 的大作中提到】
: 又到周末了，大家也许有点闲暇。版上讨论用果蝇做研究的不是很多，我在这里抛砖引
: 玉，挑战一下大家。
: 第一次挑战的题目：如何设计果蝇中的最强荧光报告基因？
: 简单的背景：
: 果蝇作为重要的模式生物，个体小，生长周期短，易于饲养，易于观察，染色体数目少
: ，能吃能睡能学习，各种研究都可以用它。种种优点让果蝇成为重要的生物学研究模型
: 。对研究人员来说，果蝇同时具备的一大优势是，有数不清的遗传学研究工具可以用。
: 就算你自己生造一种，也并不费时费力。这两年特别火的CRISPR更是把这一点推向了高
: 潮。那么，最常见的一种研究手段就是用一些人为设计的转基因工具，操控果蝇的基因
: 表达，从而改变某些细胞中的基因功能。以过表达为例，一个简单地UAS驱动的转基因
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s********x
发帖数: 472 | 10 看看rubin的pnas，可以提高你的表达量20倍。 |
