Z******5
发帖数: 435 | 1 只有多试几条引物了。
但我做的和你不一样，我设计的引物用普通Taq或者即使是专门扩高GC的kit也有很多非
特异性的，但是用Real Time的kit就非常好。 顺便说一下我用的是Brilliant
Brilliant® II SYBR® Green QPCR Master Mix (Stratagene)
另外引物拿到后就不要用普通的试来试去了，没啥意义，直接找几种做Real Time的kit
上就行了。 |
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j****x
发帖数: 1704 | 2 非特异扩增可有时可以通过提高退火温度来消除，或者使用probe来提高qPCR的特异性
，另外，你可能还需要片段化一下你的模板genimic DNA，
如果你的非特异条带的溶解曲线和实际产物差别较大的话，在有些机器上可以直接排除
在读取范围之外从而消除对定量的影响 |
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a***y
发帖数: 19743 | 3 我觉得这个结果也不可全信，虽然设计比较robust
但是你不能rule out其他因素导致你这次试验所有的replications都受到了同样的影响
导致某个结果。
我觉得更可信的结果需要至少重复一次。
而且这个实验室对重复都到神经质的程度
所以不重复试验实在匪夷所思。
qPCR需要重复做一次吗？
他们不做。我以前都是做两次…… |
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s******y
发帖数: 137 | 4 我最近投的RNA-seq文章就被要qPCR验证了，至于不同时间做出来的结果，也很难说以后就可以一直比较，我们组以前最早的数据是35bp,single end,好不容易最近用100bp Paired
end 又重测了一遍，现在新的样本又都去跳hiseq了。所以这个不同时间做出来的数据
也方便比较也很难说。 |
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j****x
发帖数: 1704 | 5 RNA-seq不需要后续验证（例如qPCR）这个说法是有问题的，不同平台不同路线（SE/PE
）做出来的结果直接比较也会有问题
总之目前在模式物种上RNA-seq谈取代microarray还为时过早 |
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j****x
发帖数: 1704 | 6 结果吻合的好，那tech水品比较高是自然的（而部分结果吻合不好也未必就意味着tech
技术有问题），但是这和你需不需要验证是两码事，好比你WB手法好结果稳定，但是不
等于你就可以不需要重复；你Y2H技术高灵敏度特异性俱佳，也不意味着你就不需要IP
等等其他实验来验证PPI。
高通量实验需要经典方法来重复验证，这基本是业内的“潜规则”，其实没什么可说的
，越是广泛运用的技术这样的要求越高（最初期的microarray的结果不需要qPCR也一样
发，广泛运用之后就不一样了） |
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s******s
发帖数: 13035 | 7 如果你发现几十个cell line, 各有几十个基因拿出来qpcr做出来没什么区别。
说明至少在自己实验室里，这两个技术是等价的，验证当然就没啥意义了，也就是
糊弄reviewer. 要验证也是从另一个角度，比如蛋白角度。
tech
IP |
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M**a
发帖数: 4816 | 8 人工抓我18年前在武大搞过的。
现在这个，是要测定单细胞代谢参数的，然后搞下来做单细胞基因表达检测的（qPCR和
RNAseq）。 |
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M**a
发帖数: 4816 | 9 其实抓这个过程很简单，问题是同时
要测定单细胞代谢参数的，然后搞下来做单细胞基因表达检测的（qPCR和
RNAseq）。 |
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m****M
发帖数: 360 | 10 建议你做个qPCR看转录如何。这样你可以知道你的基因表达高低，插入的位点是否影响
转录。然后在讨论后面用什么方法提高信号。否则会浪费很多时间和精力 |
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g*****d
发帖数: 27 | 11 谢谢楼上的，不同的primers都试过了，不同的水也试过了，不同的dNTP
concentration也试过了。用的是bulldog的Taq，都会出现size相同的dimers. 但是奇
怪的是用QPCR的mastermix试过后，出现了不同Size的bands。真是相当奇怪。
sequence在lab的电脑上，周一才能拿到。请楼上的兄弟帮忙分析下，谢谢。 |
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V***b
发帖数: 3419 | 14 很多文章一旦qPCR发现某个基因的mRNA水平高，就断定是transcription水平的调控。
好像也没有人去细究这些。其实mRNA 3' 端结合很多蛋白来调控mRNA的稳定性，保持不
被降解，从而在转录水平不变的情况下，mRNA水平上升。大家说说如果mRNA水平高，还
有哪些可能性造成？
另外就是如何设计实验区分这两种可能性呢？ |
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V***b
发帖数: 3419 | 15 谢谢各位。这个nuclear run-on不错，检测transcription rate，而不是像qPCR那样只
检测transcript expression level。我在想反应时间应该很重要，时间长了，比如6个
小时，mRNA肯定游走出细胞核，mRNA的稳定性也会影响信号强度，最后的结果就不好解
释了。反应时间短的话，10分钟，信号会弱的看不到，实验难度就会太大。谁了解mRNA
转录，转移，降解的大致时间点？谁有这个实验的protocol？ |
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m******5
发帖数: 1383 | 17 不懂，瞎说一下
做个qPCR RNA水平做internal control
用westernblot比蛋白水平？ |
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b******k
发帖数: 1874 | 18 抛开你那些理论上的讨论，肿瘤和mice之间的血管/淋巴通道是怎么样分布就有点意思。
。。。
我做的一批肿瘤，同一组的，有些剪着剪着，忽然就出现一大汪液体（感觉不是从里面
流出来的），而另外一些剪完了都没有。但是从qpcr的结果看，NK细胞marker，比如Nk
p46，组内误差很小很小。
这个有点离题了，呵呵。 |
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n********k
发帖数: 2818 | 19 This is so great and thank you very much.
1. the Antibody is at least decent---this gene has been chipped many many
times by many labs; and I confirmed the ChIP using QPCR...
2. I have been suspecting we may have the library overload problem or over-
amplification issue(if that makes sense). The core really followed the
histone protocol and was meant to get 20-30M reads, and it did for Histone
markers and Input DNA. However, for my TF, the 1st is 9M with 9% mappable
reads (I expect less bind ev... 阅读全帖 |
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j****x
发帖数: 1704 | 20 没错，之前非常困扰我的问题之一就是qPCR，每个板子里总有2-3组triplicates中间能
差出1-2个Ct，剩下的也好不到哪里去。现在改用机器手了不用再担心这个问题，但是
绝大部分实验总是没法都用机器完成啊 |
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m*********n
发帖数: 215 | 21 what....I mean, you do not even know what DNA sequence you want to be "
riched", how do you know they are "riched" without sequencing? Are you just
wanna generally look at what this TF binds in the whole genome, or you are
testing whether it binds to a specific gene?
Ok, 先做library来获得更多的DNA.
Then... do you know the consensus binding sequence of this TF?
If not, and given that you do not have a positive control, you really need
to send the library for deep sequencing, and compare to control IgG-Ch... 阅读全帖 |
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m*********n
发帖数: 215 | 22 You can just use input DNA and Antibody-ChIPed DNA for sequencing. For
quality control, your sequencing core facility will run the test for you, e.
g. Bio-analyzer chip etc.
One thing just hit me... at least in our hand, the DNA fragments needs to be
smaller for sequencing than for qPCR... I assume that you checked your
sonication efficiency and know the size of your smears before you did ChIP..
. Again, the best way is to talk to your sequencing facility and ask them
for technical details. This... 阅读全帖 |
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a****l
发帖数: 125 | 23 各位，本人加了drug treatment 后看到mRNA 的表达有变化（QPCR)，但做western 后
蛋白没太大变化，怎么办？mRNA 的变化有2－3 倍。是不是不好在蛋白水平看到变化？
谢先。 |
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d****d
发帖数: 214 | 24 顺带问一下如何离心回收少量的细胞。
我也是要从少量的细胞中提RNA然后做qPCR。之前要做FACS staining 淋巴细胞, 然后
sort出大约1000个细胞在0.5ml的buffer中。所以提RNA前要将细胞沉淀。但因为细胞太
少，即使全部离心下来也不可见。所以想请问一下大家有什么高招可以确保细胞都离心
下来。 |
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a********k
发帖数: 2273 | 25 只有两种的话直接就跑PAGE不就行了么,用qPCR仪的melting curve也行啊。。。反正他
也就看个比例。用NGS？分别克隆测序？牛刀杀鸡也不至于这么傻吧
便宜
work |
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p*****m
发帖数: 7030 | 26 呵呵 来了个fish person。。你看最近有篇fish ZFN就是用的NGS，有几篇cell line
ZFN也是。还是很方便的啊，而且超级便宜其实，一个pool可能测序100快都不到吧，因
为可以mix几个pool一起
page看不出来point mutation吧，qPCR怎么看？好像也看不出point mutation吧 |
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a********k
发帖数: 2273 | 27 PAGE用denature的，可以看SNP，以前做mapping的人用SNP做marker就是这么跑的
现在的qPCR仪都有HRM功能，也可以看SNP |
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b******s
发帖数: 193 | 28 不知版上 有没有同修 做过 punch brain 特定的 region，然后做qPCR，有些问题请教
得到tissue之后，用什么kit 提取RNA 效果最好？我这里 一直没有拿到 很好的 260／
280 ratio
感激 |
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t*d
发帖数: 1290 | 29 参考一下这个：
A major problem with validating RNA-Seq expression estimates is that there
is no clear 'gold standard' for expression estimation. Comparison of RNA-Seq
to microarrays has suggested that the former technology is more accurate
than the latter. We examined the recently published NanoString nCounter gene
expression system, but noticed many unexplainable outliers and high
variance between technical replicates (see Figure S4 of Additional file 1
and data in Additional file 2). Quantitative rev... 阅读全帖 |
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j******3
发帖数: 5244 | 30 唉，其实很多人没做也投了，文章也收了
有钱的老板砸钱灌水而已 |
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S**********l
发帖数: 3835 | 31 我觉得那是必须的。我们刚做了一个，也就80%是真的。。。。 |
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C*****h
发帖数: 926 | 33 做了，更加增加数据的可靠性，可以发到更好的杂志。
数据越多越好。越有说服力。 |
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l********s
发帖数: 70 | 36 最近发现 内参基因有时候换掉了，结果可能会不太变化，有肯会变化很大。
请问兄第们如何选内参啊。总不能说那个能得到好结果用那个，，，
心里话，觉得qPCR 是个不太靠谱的东西。 怕了 |
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r******y
发帖数: 21907 | 37 对了，我有一个跑胶跟qPCR结果不一致，跑胶表达量几乎没有，q出来根control没区别
。。。 |
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c********d
发帖数: 75 | 38 从western blot来看，蛋白降解的碎片很多，ms图谱分析恐怕很复杂，何况我们手里也
没有什么标样对照。
现在我觉得靠谱一点有qPCR。还有什么别的吗？ |
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w******e
发帖数: 1187 | 39 why qPCR? how do you know the correlation with protein degradation?? |
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a**********t
发帖数: 65 | 40 请那位同学给讲一讲，好吗？本人在这方面是新手。 |
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k********n
发帖数: 136 | 41 有个系的老鼠要做ｑＰＣＲ鉴定转基因是杂合子还是纯合子．
方法１ 尽量把尾巴剪得一样长，用蛋白酶Ｋ消化后，用乙酸氨沉淀蛋白，再用异丙醇
或乙醇沉淀，都是浑浊的雾状，消化好的，可以看到螺旋絮状ＤＮＡ，但ｑＰＣＲ结果
不好．
方法２ ＮａＯＨ消化后，Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ中和，离心直接ｑＰＣＲ．
两个方法好像结果的变异都比较大，有时候很难区分１ｃｏｐｙ和２ｃｏｐｙ．
大侠们觉得我哪里做的有问题呢？ 先谢谢了 |
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h****6
发帖数: 229 | 42 How many samples do you have? Can yo use a kit just to verify that your
method works on true pure DNA? Without internal control, i think 1 Ct
difference is hard to be consistently detected. |
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k********n
发帖数: 136 | 43 是用ｔａｑｍａｎ的ｐｒｏｂｅ做引物的，用持家基因的ｐｒｏｂｅ做内参．
给我们老鼠的组也说没法完全分开，他们的方法是，不清楚的用ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂ
ｌｏｔ鉴定．．．．． |
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k********n
发帖数: 136 | 44 我没用ｓｏｕｔｈｅｒｎ，刚开始老鼠少，还可以采样后做ｉｎ ｓｉｔｕ鉴定，现在
baby boom, 这么搞要累死人的 |
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a*****g
发帖数: 543 | 45 既然这么重要，弄个kit 提genomic DNA吧。
然后最好用plasmid做个standard curve |
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a******a
发帖数: 283 | 46 文献上查到的材料说我用的这个病毒株在细胞里的蛋白合成比其他的要少（但是他们用
的是pulse label然后跑胶显影得的结果）；我们用western blots的话，发现实际上感
染了这个病毒株的细胞里的病毒蛋白远远要比其他的多。现在问题是，需不需要重新做
其他组做过的pulse label的试验。我的意见是，我们有逻辑的数据分析（qPCR数据证
明该病毒株感染后细胞内的病毒dna也比其他的要多很多），所以没必要做那个试验，
但是老板的意见是一定要做这个试验。我认为是浪费时间。因为有其他的问题更需要回
答。
有经验的看看，这种情况有没有可能？就是学术讨论以下。谢谢。 |
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X***n
发帖数: 366 | 47
TaqMan microRNA qPCR array: single cell level. |
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h*********o
发帖数: 71 | 48 本人是在读phd, 大概还有1年毕业,专业是食品安全(用qPCR检测食品中的致病菌,纯粹
的bench work),最近一位认识我的教授说他可能需要一个博士后做一些食品安全的
extension，问我有没有兴趣和他做.因为只和他初步谈了这事，还没有涉及待遇及签证
的问题，我对这个教授（加拿大人）的印象还是很好的。请有经验的前辈谈谈
extension和lab work在工作内容及特点上的区别。extension的经历对今后在美国或中
国学术界找faculty的职位有帮助吗？ 谢谢。 |
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a***y
发帖数: 19743 | 49 别人的实验数据帮分析。
有三个replicate的control，用来作为基数算实验组fold change的
有些时间point，replicate之间Ct差异较大。如果efficiency是1，1 Ct是大约2倍，那
么有些时间段内
9个(3 x 3)Ct值的range差异可以有常常大于2-3，有个时间段range有4-5。
这个control还能用么？这个实验数据还能发表么？
相比之下各个实验组内的数据Ct差异都很小。
我感觉这个control差异这么大，作为基数很problematic，而且差异这么大的Ct值做算
术平均数距离真实值差异也太大了，必须换一个算法。（以前版上有人求excel表格，
还有没有啊？）
谢谢了！发包子感谢回答的。 |
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