y*********u
发帖数: 183 | 1 研究这种问题靠qpcr而不是rnaseq简直就是行为艺术
还有楼上也说了，奇奇怪怪的transcription events多海了去了，没phenotyoe 支持没
什么好做的 |
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h*********g
发帖数: 18 | 2 我作的qPCR，一个基因的cycles在control条件是36 or 37 cycles，在刺激下的cycles
是 30 cycles。请问这是否表明此基因表达升高很多倍？好像35个cycles以上就不准了
？多谢！ |
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A******y
发帖数: 2041 | 3 Not only that, is your primers still linear at cycle 30-36? Did you check
the linearity of the primers? I know a lot of people don't do qPCR
correctly. |
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A******y
发帖数: 2041 | 4 So how much RNA or cDNA sample do you add to your qPCR? What you do is take
a sample (usually control), do a x2 serial dilution and see if your cycle
is close to a single cycle per dilution and if it is linear. It is call PCR
amplification efficiency. It doesn't have to 100% but I think you should
have >90% and linear. |
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f*******e
发帖数: 628 | 5 通常 qPCR 会 report PCR efficiency. taqman 通常 efficiency 应该接近 100%. 如
果持续低于 95%， 说明 primer/probe design 有问题。
Ct大于30之后基本上就不太reliable了。做了no template control么? 离你的sample
的 Ct远么？ |
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s*****7
发帖数: 96 | 6 求助本版的大侠和高手一个问题。小弟我最近遇到一个问题。我设计了一组primer 和
probe 用于TaqMan QPCR. 在RDP上可以查到每一个primer 或者probe的coverage 在我
所要扩增的种属里面。但是，我现在想知道要是我用一套set（two primers and one
probe)在这个种群里的coverage. 这个可能牵涉到miltiple probe overage的问题。
哪位高手以前要是做过这方面的工作，能否指点一下，多谢。 |
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B*D
发帖数: 5016 | 7 从北朝转的
http://www.cctvdream.com.cn/bbs/forum.php?mod=viewthread&tid=51
ge%3D1
注：由于之前实验室有同事认为本文对之前实验室的研究细节有泄密嫌疑，因此文章做
了删节处理。当然，公开发表的文献懂行的读者能猜出这些此处已删除的背面都是什么
，就请大家给个面子，不要人肉了。前面一段主要是让大家直观了解一下现代尖端生物
研究中上下游的长度，QA，QC的复杂性和研发技术平台的长期性。花十年，2-3代博士生
打造世界一流技术平台的艰辛，真的很不容易。这也从一个侧面阐述了“引进即落后，
追也追不上”的怪圈的产生原因，并通过一个例子来讲述怎样打破怪圈，建立世界一流
技术平台。
小议生物学研究中的技术平台的作用
上个月，我以前的实验室（后文为了描述方便，称为北大实验室）发表了一篇Cell的封
面文章，这是一个非常难得的成果。关系挺铁的哥们发了好文章，让人激动不已。关于
这篇文章的科学意义，Cell有专文评述，网上也有很多文章讨论，这里就不多谈了。笔
者特别欣慰的是，这篇文章标志着北大实验室相关技术平台达到世界一流水平。这个技
术平... 阅读全帖 |
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g*********3
发帖数: 177 | 8 有点不同意见，说出来大家讨论下。
1. 如果是error bar太大了，是不是要考虑实验重做。我个人觉得replicates内部Ct在
0.3左右都可以接受，有些人要求严格的在0.1左右，否则就重做了。
2. 现在大家paper里好像也不强调biological replicate了。至少我觉得实验重复几次
才算是可靠的。
3. 如果不是实验系统本身的复杂性，控制好了以下几个因素，CHIP-QPCR的结果应该是
很可靠的：
crosslinking, sonication, Ab/Beads, reverse-crosslinking.
我一般处理CHIP-SEQ/QPCR都有大概10个sample，每个sample的Input(包括Mock 和 IP
的), Mock IP.etc，这些sample的Ct应该要接近甚至一样才算可靠，所以你应该有个标
准，自己的实验是不是很可靠了（这个实验其实用Input做啥normalize的都没有必要了
）。
至于那些error bar太大了，primer是不是可靠的，sample（尤其是input）有没有做过
dilution的standard ... 阅读全帖 |
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q***7
发帖数: 144 | 9 你如果用的是Qiagen 或其他公司的柱子提的RNA，那你有没有考虑过RNA样品中的洗液
的影响？
尤其是RNA浓度低的样品。因为要调成和浓度高的样品一样的总量，所以要加的比较高
的体积。这样在反转录体系中这个低样品的洗液就多，抑制反转录酶的活性很强。所以
你虽然放了一样多的总RNA，但是大多都没有被反转录。当你所qPCR时，你这个样品的
Ct值会很高，意思就是表达很低。所以就是给你表达低的假现象。你做qPCR时，可以留
意一些低浓度样品的Ct值。很多人发表的qPCR的文章后来表明结果相反，有一些原因是
这些研究者没有考虑这个原因。
这是我给另外一个贴子的回复
Qiagen柱子提取的RNA总是含很多的洗液。后面会影响到反转录酶的活性。如果每个样
品的浓度不一样，你做qPCR时，要调成一样的浓度，这样你做反转录的每一个样品的反
应液里含有的洗液浓度就不一样。不一样的洗液浓度，抑制反转录酶的程度也不一样。
这样你最后出来的qPCR结果肯定不准确。有的样品里表达低，可能是因为洗液多而抑制
了反转录酶造成的，而不是真正的表达低。如果你同一组的样品，有的表达高，有的表
达低，一般都是这个原因造成... 阅读全帖 |
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q***7
发帖数: 144 | 10 你如果用的是Qiagen 或其他公司的柱子提的RNA，那你有没有考虑过RNA样品中的洗液
的影响？
尤其是RNA浓度低的样品。因为要调成和浓度高的样品一样的总量，所以要加的比较高
的体积。这样在反转录体系中这个低样品的洗液就多，抑制反转录酶的活性很强。所以
你虽然放了一样多的总RNA，但是大多都没有被反转录。当你所qPCR时，你这个样品的
Ct值会很高，意思就是表达很低。所以就是给你表达低的假现象。你做qPCR时，可以留
意一些低浓度样品的Ct值。很多人发表的qPCR的文章后来表明结果相反，有一些原因是
这些研究者没有考虑这个原因。
这是我给另外一个贴子的回复
Qiagen柱子提取的RNA总是含很多的洗液。后面会影响到反转录酶的活性。如果每个样
品的浓度不一样，你做qPCR时，要调成一样的浓度，这样你做反转录的每一个样品的反
应液里含有的洗液浓度就不一样。不一样的洗液浓度，抑制反转录酶的程度也不一样。
这样你最后出来的qPCR结果肯定不准确。有的样品里表达低，可能是因为洗液多而抑制
了反转录酶造成的，而不是真正的表达低。如果你同一组的样品，有的表达高，有的表
达低，一般都是这个原因造成... 阅读全帖 |
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m***r
发帖数: 133 | 11 帮朋友发招聘信息，如有兴趣请发简历至email: c*****[email protected]
If interested, send a copy of resume to c*****[email protected]
(1) Web Architect
This role is instrumental in designing and delivering qPCR Consumer &
Business related applications that will help to propel Life Technologies
qPCR products into the internet & mobile space, make Life content accessible
to more devices, integrate with key partners in the cloud, and allow Life
Technologies qPCR services to scale with rapid growth in users.
We are seeking an indiv... 阅读全帖 |
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b***y
发帖数: 2799 | 12 ☆─────────────────────────────────────☆
jinyiyushi (花猫) 于 (Sat Aug 25 19:02:48 2007) 提到:
今年的H1B名额用完了。 拿到一个工作的offer。 不知道可不可以先办J然后再转成H1B
。 这样做会有什么样的危险性。 需要经过什么样的程序。 如果有高人知道， 请指点
一下。 万分感谢！
☆─────────────────────────────────────☆
qPCR (qPCR) 于 (Sat Aug 25 19:13:50 2007) 提到:
J1 要满一年才能申请Waiver，有waiver才能申请H1。
☆─────────────────────────────────────☆
jinyiyushi (花猫) 于 (Sat Aug 25 20:11:40 2007) 提到:
怎么申请waiver， 如果没有申请到会有什么后果。 会不会一定要先回国呢？
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qPCR (qPCR |
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Z******5
发帖数: 435 | 13 可能我表述的不完整，不清楚，还是重新说一次。
两个样品--实验组&对照组， 两对引物--目的基因和内参， 假设每个只做一管，不用
做重复，那么最后是4管反应体系。加样顺序有两种：
1，分别加一个2x的 实验组cDNA，qPCR MIX, Dye，H2O 和 对照组cDNA，qPCR MIX，
Dye，H2O， 然后再分别分装成两管，最后分别加引物。
2，分别加一个2x的 目的基因引物，qPCR MIX, Dye，H2O 和 内参引物，qPCR MIX，
Dye，H2O， 然后再分别分装成两管，最后分别加cDNA。
我觉得1更合理，但是很多kit的protocol上是最后才加cDNA。 |
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m**********d
发帖数: 137 | 14 新手请教：
在做Polii-ChIP-qPCR,在qPCR这步怎么normalize，看protocol上建议留input，最后
qPCR这步normalize to input。可是reverse crosslink之后DNA yield这么少，留1%的
input能准么？我想请问，能不能不留input了,qPCR这步normalize to GAPDH行么，反
正treatment也不影响Polii binding.
还有另一个问题，reverse crosslink之后大家都怎样recover DNA，我过了个QIAGEN的
柱子，yield挺低的
谢谢～～ |
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l***s
发帖数: 841 | 15 I did some comparative analysis using our own qPCR, RNA-seq, and nanostring
data. Looks like qPCR is still the best. Of course, it is a challenge to
analyze several hundred genes using qPCR. Typically, we still need to
validate nanostring data using an independent approach such as qPCR. |
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发帖数: 1 | 17 非洲猪瘟病毒微滴数字PCR (ddPCR)方法的建立及应用
邬旭龙1Δ, 肖璐2Δ, 宋勇5, 林华4, 陈世界4, 杨苗4, 安微4, 姚学萍1,3, 杨泽晓1,
3, 王印1,3
摘要：【目的】 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)能导致猪群高死亡
率，从而造成严重的经济损失。因此，建立严密、高效的防控系统，包括灵敏、准确的
诊断方法以及高效的预报预警机制等，以避免ASF传入我国。本文旨在建立一种新型而
高灵敏度的ASFV微滴数字PCR (Droplet digital PCR，ddPCR)检测方法。【方法】 针
对ASFV K205R基因设计一对特异性引物和TaqMan探针，通过反应条件优化，建立了ASFV
实时荧光定量PCR (qPCR)和ddPCR检测方法；并对两种方法的线性关系、灵敏性、特异
性和重复性进行了评估，利用建立的ASFV检测方法对163份国内和进境的组织样本及血
清样本进行检测，血清样本经商品化ASFV ELISA试剂盒复检，评估不同方法检测结果的
符合率。【结果】 建立的ASFV qPCR和ddPCR检测方法线性... 阅读全帖 |
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m****M
发帖数: 360 | 18 有多少人在做qPCR？
你愿意用公司服务吗？
如果不用，你最关心的是什么？
本人做qPCR已经超过５年，感觉非常在行。本人想提供qPCR服务，一个样给做４个重复
，20ul的体系，整个计算下来要比自己买试剂做便宜。如果加上仪器费会省更多。
overnight服务。第二天可以得结果。每次都有至少三个免费的内对照基因。
另外，如果你实验室在做老鼠Genotyping Screening,是否愿意用公司服务。
谢谢大家的帮助 |
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c******r
发帖数: 3778 | 19 这个很简单，仔细想想就明白了。
当然不可以。random primer不能用来做qPCR。原因是这个是random的，所以对各个RNA
的RT efficiency是不一样的，所以以后的qPCR都没意义了。
如果要qPCR可以用polyA或者target specific primers。但是也不能混用。原因是
polyA会RT，而你的specific primers也可以RT，结果是你的target被polyA和specific
primers分别RT，而QC只被polyA RT。但是poly A和specific primer的RT efficiency
是不一样的，所以二者不再可比。
所以只能要么用poly A，要么target和control都用specific primers。
btw，gapdh的做RT是有kit的，买一个就可以了吧？
QC； |
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l***s
发帖数: 841 | 20 We often use qPCR to detect 30% change (with duplicated reactions). qPCR is
most sensitive because of the signal ampplification process. We sometimes
use qPCR for about 100 cells with good sensitivity.
cycle |
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r*m
发帖数: 16380 | 21 QPCR是可以给出30%差距这样的“数据”，但是理论上这是“错误”的。因为PCR反应前
几步理论上可以差一个cycle，也就是2倍的差距。
这不是我自己想出来的，是设计QPCR的公司反复测试的结论。
所以普通QPCR只能报告2倍以上的差距（可靠），2倍以下都是不可靠的。
is |
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r*m
发帖数: 16380 | 22 我们刚买了biorad的QPCR系统，培训的时候专门讨论了这个。
还有更高级的QPCR（不太普及），可以精确到10%这个范围。
用普通QPCR定量到20-30%，某种意义上是欺负reviewer也不懂。 |
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y********g
发帖数: 782 | 23 目的是想要证明A和B两个转录因子binding在一起。
方法1：IP
方法2：荧光显微镜
问题在方法3：如果想证明两个转录因子physical binding在一起，哪个方法是对的？？
a) 用抗体拉A，然后+蛋白酶, 做qPCR (引物直接用设计好的，跨B的binding site的）
b) 用抗体拉A，然后用抗体B拉，然后+蛋白酶, 做qPCR (引物直接用设计好的，跨B的
binding site的），那还要不要做 qPCR 来检测 A的binding activity 啊 (用第一次
Chip的样品，还是用Re-CHIP的样品来测啊？）Re-CHIP的时候，不可避免的会有丢失哦
~~
这个实验可行么？
谢谢~~~ |
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l**********1
发帖数: 5204 | 24 qPCR mouse tail tissue extraction DNA
pls refer,
>The SM22aCre-ERT2 mice (Kuhbandner et al. 2000) were generously provided by
Robert
Feil (Interfakulta¨res Institut fu¨rBiochemie,Universita¨tTu¨bingen,
Germany). SM22a protein binds actin and contributes to
smooth muscle contractility ( Je and Sohn 2007; Assinder
et al. 2009) and is expressed specifically in adult smooth
muscle cells of the vasculature and viscera. Genotyping
primers used are listed in supporting information,Table S1.
Genotyping ... 阅读全帖 |
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t**********n
发帖数: 283 | 25 交流交流，谢谢。
1.关于standard curve, 我的理解就是确认PCR amplication efficiency,只要你的样
品DNA好的，为什么一定要用实际IP的
样品量（1/20, 1/200, 1/2000 and 1/2000 of ChIP input）standard curve？当然
如果模板浓度太低，amplication curve may be an issue。
我过去的经验是cDNA样品反复冻融会影响amplication efficiency.
此外如果倍数差别很大比如10倍以上的话就没有必要做standard curve，因为即使扩增
效率低也不会影响到最终结果。
我觉得对一对引物做一次就够了。
2 “qPCR本身是有每次
PCR循环的数据的。根据linear range的扩增曲线，是很容易算出primer的efficiency
的（有的软件会自动给出这个值），然后可以根据这个来定量。”
我以前想过机器应该能自动给出这个效率，但从来没见过，楼主能否说出具体的机器或
软件？
关于这个standard curve，我想探讨下。
我们老板，要求我们... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 26 最近做一个DNA damage的实验，就是用H2O2来诱导Hek细胞基因组oxidative damage；
然后用FPG这种能识别8-oxoG的酶来切，被切的基因组位点会产生nick，阻碍PCR
polymerase，基于这样的原理做qPCR定量来研究某段序列对于oxidative damage的反
应。
好像这种做法比较少见，大部分DNA damage的研究都是global的。但也有很好的先例比
如：
http://www.nature.com/nature/journal/v429/n6994/abs/nature02661.html
这篇经典的Nature 文章
我按照这篇文章的做法，把genomic DNA进行FPG overnight digestion （DNA+FPG+Neb
buffer+BSA），同时也做了mock control（DNA+水+Neb buffer+BSA），然后qPCR发现
Ct如下：
DNA：25
DNA+FPG+buffer：28
DNA+水+buffer： 28
让我惊讶的是，相比于纯DNA，mock control的DNA+水+buffe... 阅读全帖 |
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c*********d
发帖数: 9770 | 27 荒猫牛不耕微信号laoniu003005
功能介绍
好文分享
来源：荒猫之舞
作者：荒猫
中美贸易战告一段落，毫不意外地，咱们又赢了。不过与以往不同的是，这次美国也赢
了，是双赢。据报道，咱们答应了美国减少贸易逆差的要求，所以美国赢了；而因为要
减少贸易逆差，中方将大量增加自美购买商品和服务，这样可以满足咱们不断增长的消
费需求和促进高质量经济发展，所以咱们也赢了。
但让我感觉不可思议的是，这么好的事情，为什么一直不做呢？为什么要在美国政府的
逼迫下去做呢？是因为没有想到？那岂不是说那些人能力低下？是因为想到了而不做，
那岂不是证明了那些人很坏？
而且在美国高调启动贸易战之初，咱们是抱着多大的决心，宁为玉碎不为瓦全，一定要
打赢的，一定要粉碎美国人阻挡咱们大国崛起的阴谋的。当美国提出500亿的清单时，
咱们针锋相对；当美国提出1000亿的清单时，咱们继续应战；而当美国把清单的总价提
高到2000亿的时候，一夜之间，美国就不是阻挡咱们大国崛起，而是有利于咱们大国崛
起了。美国的要求原来是有利于咱们的发展，而不是遏制咱们的发展了。我恍然大悟：
原来以前的针锋相对，是用的激将法，是为了刺激美... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 28 ddPCR 没有问题的，放心吧，只有假阳性，没有假阴性
Digital PCR as a tool to measure HIV persistence
Although antiretroviral therapy is able to suppress HIV replication in
infected patients, the virus persists and rebounds when treatment is stopped
. In order to find a cure that can eradicate the latent reservoir, one must
be able to quantify the persisting virus. Traditionally, HIV persistence
studies have used real-time PCR (qPCR) to measure the viral reservoir
represented by HIV DNA and RNA. Most recently, digital P... 阅读全帖 |
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l****u
发帖数: 8729 | 29 ☆─────────────────────────────────────☆
sesky (穿越时空的思念) 于 (Sun Mar 22 20:45:46 2009) 提到:
http://edu.ce.cn/young/teach/200902/13/t20090213_18193729.shtml
看来何绍强真是牛b了
☆─────────────────────────────────────☆
paopao1997 (paopao) 于 (Sun Mar 22 20:53:17 2009) 提到:
去卖B吧
☆─────────────────────────────────────☆
qPCR (qPCR) 于 (Sun Mar 22 20:58:46 2009) 提到:
三人都是美国公民可以送回美国找人收养。贝家尽管被搞得倾家荡产但估计还是会收留
贺梅的。拿自己孩子当人质真是禽兽不如，背后的军师也总会有报应的。
☆─────────────────────────────────────☆
sesky (穿越时空的思念) 于 (Sun |
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a******5
发帖数: 5 | 30
工作地点:
北京天津
薪金:
年薪近20万元
学历和研究方向:
硕士生物化学
招聘岗位:
项目负责人
公司名称:
Creative Dynamics
联系方式:
[email protected]
/* *//010-58426714
基因组学项目经理
岗位职责：
1. 从事基因组学相关项目的研发及服务;
2. 落实项目的进度目标,保证项目的正常实施,优质高效地完成项目任务.
3. 做好项目的基础管理工作,保存各文件,记录,数据等资料;
4. 为海外客户提供优质高效的产品和服务售前售后技术支持工作，维护目标客户；
5. 制定工作计划，定期进行工作总结. 完成公司规定的国际业务相关的各项工作任务。
职位要求：
1. 医学或生物学硕士及以上学历；
2. 熟练阅读中、英文资料，独立完成实验方案的设计及实施.
3. 英语六级水平以上，能够熟练进行英语交流和报告写作，能以英语作为工作语言与
国外客户进行无障碍交流，熟练掌握Office 2010办公软件；
4. 具有较强的责任感. 组织管理能力. 协调沟通能力. 分析和解决问题能力及创新和
团队协作精神；性格稳健. 认真踏实... 阅读全帖 |
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s********8
发帖数: 18 | 31 分子诊断项目经理
岗位职责：
1. 负责与国内外客户沟通，为国内外客户提供分子诊断相关产品和服务（qPCR、FISH
、二代测序等）的售前售后技术支持工作，维护客户关系；
2. 负责分子诊断相关产品和服务的市场调研工作，与国内外优质厂商洽谈OEM合作，采
集整理产品和服务的相关信息；
3. 负责相关产品市场推广方案的指导与建议；
4. 协助注册人员开展产品在FDA、CE、CFDA的注册工作；
3. 制定工作计划，定期进行工作总结；
4. 高效完成上级领导交待的其它工作任务；
职位要求：
1. 分子生物学，细胞生物学，生物化学，免疫学，微生物学，生物信息学、医学等相
关专业，硕士及以上学历；
2. 具有实验室项目研究经验，熟练掌握分子生物学实验技术及理论知识，有分子诊断
产品研发与推广（qPCR、FISH、二代测序等）经验者优先；
3. 英语六级水平以上，能够熟练进行英语交流和报告写作，能以英语作为工作语言与
国外客户进行无障碍交流，熟练掌握Office 2010办公软件；
4. 较强的事业心及责任心，能够在快节奏的环境中工作，吃苦耐劳，有较强的承担压
力能力。
工作地点:
北京天津
薪... 阅读全帖 |
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b***y
发帖数: 2799 | 32 ☆─────────────────────────────────────☆
wdusa2006 (当当) 于 (Thu Aug 9 00:04:09 2007) 提到:
回来时是不是有问题
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kitkat (kitkat) 于 (Thu Aug 9 00:12:35 2007) 提到:
you don't have even one baozi
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wdusa2006 (当当) 于 (Thu Aug 9 00:33:28 2007) 提到:
搞点包子还不容易，你再看
☆─────────────────────────────────────☆
qPCR (qPCR) 于 (Thu Aug 9 00:58:13 2007) 提到:
要有AP。
☆─────────────────────────────────────☆
ruler (firebird) 于 (Thu Au |
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b***y
发帖数: 2799 | 33 ☆─────────────────────────────────────☆
azureangel (lucky) 于 (Tue Feb 26 18:31:09 2008) 提到:
主申请人(eb1b)的140和485是去年7月交到NSC的，还没有消息。
两人的EAD, AP都已经到了。
副申请人(F1)的I20今年9月到期，本来想在9月前不用EAD卡，因为
毕竟140还不知道是否可以批准，想在之前保证身份受影响。
想问一下，如果副申请人用了EAD的话，是不是绝对就没有可能保持
F1了？万一将来140没有批准，副申请人不用EAD和用了EAD有没有什
么区别呢？
多谢多谢！
☆─────────────────────────────────────☆
qPCR (qPCR) 于 (Tue Feb 26 18:36:31 2008) 提到:
用EAD的当天F1作废。何况你用EAD应该是去打工或者其他地方，不会是在F1的同一个学
校吧，怎么可能不知道。
万一将来140没有批准，副申请人不用EAD和用了EAD有没有什
不用EAD的还是F1直到I-20过期日期。用的EA |
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b***y
发帖数: 2799 | 34 ☆─────────────────────────────────────☆
flydance (洗澡淹死的鱼) 于 (Sat May 10 14:10:34 2008) 提到:
据说F1申请绿卡如果被拒，连保持F1身份和申请OPT都会成问题。
能否这样：
我老公是H1，申请绿卡先，他的140和485如果被拒，只要不用劳工卡，就没问题对吧？
如果申请成功了，我F1再递交申请140和485就不用排期，也没被拒危险吧？多谢！
☆─────────────────────────────────────☆
qPCR (qPCR) 于 (Sat May 10 14:18:58 2008) 提到:
已经有的F1不受影响，但不能转学、出境或者申请OPT。
对。用EAD也没有太大关系，万一140被拒立即办H1加急并同时出境签H1。
对，但家属不用140只要485。
☆─────────────────────────────────────☆
rockme (flyinggame) 于 (Sat May 10 14:27:54 2008) 提到:
is your h |
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b***y
发帖数: 2799 | 35 BZ: 被封原因在此帖:
http://www.mitbbs.com/article_t/Immigration/31280091.html
*[0;1;32m☆────────────────────────────────
──
───☆*[0;37m
*[0;1;32m stonebobo (彩旗飘飘~~) *[0;1;37m于 *[0;1;36m (Wed Sep 24 11:54:
36 20
08) *[0;1;37m 提到:*[m
其实p838 比很多ID都厚道~~~
某些ID见不得别人有好处,自己是A类, 就诅咒B类的排期大大退步..
要我说, 都搞窝里斗有什么意思啊??? 跟那些骂我不爱国的有什么区别??? 我就不公开
这些爱国的ID了, 只说一句: 您爱国您别来这里啊? 回国去啊!!! 爱国爱到美国来了,
您可真高明!!1
*[0;1;32m☆────────────────────────────────
──
───☆*[0;37m
*[0;1;32m qPCR (qPCR) *[0;1;37m于 *[0;1;36m (Wed Sep 24 11:59: |
|
T**7
发帖数: 264 | 36 杂志介绍
http://www.rsc.org/publishing/journals/MB/about.asp
Impact factor: 3.859
劳驾站内信发给我：
你的名字，你的email，你的专业特长关键词（3－5个即可），你的发表文章。
为了你省事，你可以copy paste你的resume也可以
希望不同专业都来试试，“分子生物系统”杂志算是交叉学科杂志。
谢谢！
稿件摘要：
TITLE: Noninvasive measurement of respiratory activity of mouse embryoid
bodies and its correlation with undifferentiation/differentiation markers
ABSTRACT: Mouse embryoid bodies (mEBs) were evaluated in detail on the basis
of respiratory activity and high-throughput quantitative reverse
transcriptio... 阅读全帖 |
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E******n
发帖数: 641 | 37 ☆─────────────────────────────────────☆
qPCR (qPCR) 于 (Tue Jun 12 23:37:28 2007) 提到:
砸了然后问信用卡公司要钱。
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chick (Por Los Momentos Dif Ciles) 于 (Tue Jun 12 23:46:12 2007) 提到:
我上次瞎折腾电脑，弄出了软故障，就给换了一个新的
硬盘没坏，就是我乱安装vista和xp,我映象中，是我删了系统的vista，然后自己装
XP，但是又弄坏了引导区，最后系统一开机就重启(//blush)
☆─────────────────────────────────────☆
driftingboat (四月的阳光) 于 (Wed Jun 13 00:11:44 2007) 提到:
混账店员说了，可以换，就是不能退，但是他又说了，这款电脑噪声都大...
所以不想折腾了，想退掉算了。。。
可是。。。。
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p**i
发帖数: 688 | 38 ☆─────────────────────────────────────☆
henqiangda (很好很强大) 于 (Sun May 3 15:08:51 2009) 提到:
最近折腾了个 D-LINK 321的NAS，性能实在太差了。用千兆口最多也才能用到15M/S的
读取速度。 但我发现如果家里有2台以上电脑的话，有一个NAS是很方便的，而且可以
用来下BT，架设FTP服务器，甚至如果用性能强点的硬件，还可以用来当HTPC。自己DIY
不但省钱，还可以实现更多的功能，更强的性能。。。
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Qing (阿卿) 于 (Sun May 3 15:29:02 2009) 提到:
俺家的， 旧笔记本 + 外置硬盘 + debian，呵呵
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qPCR (qPCR) 于 (Sun May 3 15:29:27 2009) 提到:
搞个home server不是更好？
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A***g
发帖数: 191 | 39 所在的实验室是一个烧钱的实验室，做几十个转录因子，实验套路大致就是qPCR和
western结合检测不同基因在不同human cell line中的表达，然后挑出表达合适的细胞
系去做siRNA和Chip-seq，目的呢，找出这些转录因子的binding site以及pathway什么
的。
我其实只是一国内小硕在这里做一小技术员，可是目前实验室没有post-doc，所以这些
实验基本上就着落在我和另一技术员身上，她负责做siRNA，其它的实验都我做。
照着protocol做实验当然没问题啊，遇到不懂的没人问就难办了。可是我成天闷头赶实
验，哪里有空看文献呢，所以就只好跟science脱节了。
做qPCR还好说（其实也有困难，另行发帖请教），我用的是GAPDH作为internal
control来计算相对表达量。可是做western时，我一开始选的是GAPDH做内对照，买的
是Sigma的抗体，做的还挺好的，因为这个GAPDH检测大小是36kd，正好跟我的目的蛋白
50-75kd能分开，我转一张膜，然后剪开就可以同时检测两个抗体。可是老板在我上周
汇报结果时说GAPDH主要在细胞质表达 |
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s******r
发帖数: 2876 | 40 Histon H1 行不行？
所在的实验室是一个烧钱的实验室，做几十个转录因子，实验套路大致就是qPCR和
western结合检测不同基因在不同human cell line中的表达，然后挑出表达合适的细胞
系去做siRNA和Chip-seq，目的呢，找出这些转录因子的binding site以及pathway什么
的。
我其实只是一国内小硕在这里做一小技术员，可是目前实验室没有post-doc，所以这些
实验基本上就着落在我和另一技术员身上，她负责做siRNA，其它的实验都我做。
照着protocol做实验当然没问题啊，遇到不懂的没人问就难办了。可是我成天闷头赶实
验，哪里有空看文献呢，所以就只好跟science脱节了。
做qPCR还好说（其实也有困难，另行发帖请教），我用的是GAPDH作为internal
control来计算相对表达量。可是做western时，我一开始选的是GAPDH做内对照，买的
是Sigma的抗体，做的还挺好的，因为这个GAPDH检测大小是36kd，正好跟我的目的蛋白
50-75kd能分开，我转一张膜，然后剪开就可以同时检测两个抗体。可是老板在我上周
汇报结 |
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t*d
发帖数: 1290 | 41 抱歉，误解了你的意思。还扬扬傻傻写了一大堆，呵呵。
这种 unknown 基因我一般是不去碰的。为什么呢？因为microarray结果的假阳性太高
了。就算你 rank 后，排在第一那个的都有可能是个假阳性。所以在做任何后续实验，
甚至简单的validation（用qPCR等方法）前，都最好综合各方面的知识，给candidate
genes排个序。然后决定试哪个。而这些未知的基因，后面要做的实验太多了。最难的
是找到它表达的蛋白，找到它的蛋白的抗体。够你折腾老长一段时间了。
当然，你有其它的证据。比如你发现在某个 GWAS 中，这个基因的 SNP 和某个疾病极
强相关，然后在你的与这个疾病相关的处理中表达变化了，然后qPCR验证了这个基因的
表达变化。这时也许值得一试。
very
Affy
to
I |
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w******e
发帖数: 1187 | 42 用qPCR的话，RNA template定量，DNA standard curve point定量，RT,qPCR
都会引进误差，比较头疼。。。我现在用这种方法将就着，测出来的RT
yield只有10~20%:( |
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p*****r
发帖数: 64 | 43 最近正在用一个悬浮细胞做high-throughput drug screen.流程很简单,就是把细胞加
在384 plate上,加上药物,3天后收细胞,提RNA,转cDNA,再做qPCR. 但是现在发现收细胞
的时候,仪器在remove medium的时候吸走了很多的细胞,使每个孔细胞数目很不一致,这
样做出来的qPCR variation太大. 目前我用V bottom的plate养细胞,不知道大家有这方
面的经验没有,怎样才能避免第一步remove medium时尽量不影响细胞的数目? 有没有可
能不remove medium,就直接在培养基里直接加lysis buffer,拿到RNA呢? 多谢了 :) |
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a*******g
发帖数: 162 | 44 想GENERATE HOMOZYGOTE的TG MICE， 请问怎么可以GENOTYPING啊，用QPCR可靠吗？需
要用TAQMAN还是普通QPCR就可以了？多谢！ |
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w******e
发帖数: 1187 | 45 想用random primer做tissue RNA的RT，然后用GAPDH specific primers做qPCR as QC；
同时用aptamer specific primers做RT和qPCR。可以在RT这一步把两种primer放在
一个reaction里做吗？有什么可能的问题？
非常感谢！ |
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m**********d
发帖数: 137 | 46 不加antibody，只加ProteinA agarose孵育1hr，作为Negative Ctrl。qPCR的结果Neg
Ctrl是实验组的1/7-1/10，请问这个强度的background能否接受？
现在做的是RNAPol2的ChIP，大家都说RNApol2的这个antibody做ChIP很不错，但我步步
按照Millipore ChIP Kit做下来，elution之后用nanodrop测了一下DNA浓度，发现特低
。请问版上ChIP大牛们，要想得到个decent qPCR结果，ChIP下来的DNA浓度有个限制么？
多谢各位指点啦 |
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R****n
发帖数: 708 | 47 you are talking about Methylation Specific-HRM, I assume. Althought you are
using qPCR system, you didn't use a beckman probe to identify the sequence
change. So this is not a qPCR method.
ZymoResearch's kit should be fine. We used their kit a lot. There are some
commercial M or UM DNA standard which have been converted. You can use them
to test your primers.
How do you design your primers? flanking any CpG sites?
If you didn't change primer, I guess that you may have PCR product
contamination i... 阅读全帖 |
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j****x
发帖数: 1704 | 48 Northern for genome-wide, no way!
花2年的时候做这个screening，浪费的时间和人力成本远高过于其他方法，这个道理你
老板不会不懂，他可能只是不在乎而已。高通量的方法初筛然后结合Northern来确认，
相信这是理性的PI会做的选择。现在的现实是，如果PI不在乎学生的这两年时间而更在
乎钱的话，你也没有必要违心去迎合他。
既然老板都提到如果不喜欢就换题，我想你也没必要想的太多了，move on。其实他心
知肚明这是个不讨人喜欢的项目，拒绝是自然的事情。如果因此而嫉恨，呵呵，这人的
rp有问题尽快闪吧。
其实，现在无论是基于芯片还是qPCR的高通量方法，成本早就下降很多了。芯片不说了
，qPCR目前发展到384孔甚至1536孔板都渐渐成为常规方法了，3万个基因筛下来成本没
多少，不是吗？ |
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z*******a
发帖数: 175 | 49
从culture cells开始还好吧
从活体组织开始还是不易的
问题最后data是qPCR的bar graph，对qPCR的bar graph挑剔的人很多
不过千万别吓着 |
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s******s
发帖数: 13035 | 50 microarry做出来的数据最后还要qPCR验证，如果基因多的话费时费事费钱。
RNA-seq和qPCR基本上完全吻合，做出来数据不需要validate, 而且不同实验室
不同时间做出来的数据也方便比较
splicing, |
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