v***a
发帖数: 1242 | 1 在做一个跟cell adhesion有关的蛋白，它在apoptosis中也会有作用。in vivo用IB看
tissue中蛋白level的变化，可以看到在apoptosis的过程中该蛋白有一个瞬时的up-
regulation（试了3个不同的抗体，结果都很consistent）；而当我从tissue中提取RNA
做RT-PCR，结果却十分不稳定（来自跟IB相同的animal，结果却都不一样，有的根本看
不到我要的gene，更别提看到induction了）。
后来就没理这个茬，接着往下做细胞培养了。现在做siRNA，发现in vitro也是蛋白有
变化，但用PCR提取培养的细胞中的RNA看的时候（用DNASE I处理过的），又断断续续
的，一会有gene一会又看不到gene（包括用control duplex及未处理的细胞）。看其它
的house-keeping gene都正常。
大家遇到过这种情况吗？按理说做siRNA，是不是在mRNA的level上的变化应该比蛋白多
的？
多谢啊！ |
m******5
发帖数: 1383 | 2 不懂的路过，据说有的时候si RNA只是起到了block其mRNA表达的作用，起不到si 本该
起的作用 |
C*********u
发帖数: 811 | 3 primer问题吧
还有就是你这个蛋白主要是post－translation modification，和mRNA level水平关系
不大
RNA
【在 v***a 的大作中提到】
: 在做一个跟cell adhesion有关的蛋白，它在apoptosis中也会有作用。in vivo用IB看
: tissue中蛋白level的变化，可以看到在apoptosis的过程中该蛋白有一个瞬时的up-
: regulation（试了3个不同的抗体，结果都很consistent）；而当我从tissue中提取RNA
: 做RT-PCR，结果却十分不稳定（来自跟IB相同的animal，结果却都不一样，有的根本看
: 不到我要的gene，更别提看到induction了）。
: 后来就没理这个茬，接着往下做细胞培养了。现在做siRNA，发现in vitro也是蛋白有
: 变化，但用PCR提取培养的细胞中的RNA看的时候（用DNASE I处理过的），又断断续续
: 的，一会有gene一会又看不到gene（包括用control duplex及未处理的细胞）。看其它
: 的house-keeping gene都正常。
: 大家遇到过这种情况吗？按理说做siRNA，是不是在mRNA的level上的变化应该比蛋白多
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A******y
发帖数: 2041 | 4 Protein stability changed? Something happened that the protein is not being
degraded. |
h****r
发帖数: 152 | 5 很有可能是泛素化途径降解，拿MG132处理下就知道啦 |
v***a
发帖数: 1242 | 6 多谢提醒。重新order了primer。
已经publish的paper都说我的这个蛋白在basal level时表达量非常低，我的mRNA显示
确实是这样。但不明白为什么IB看蛋白那么多。。。
【在 C*********u 的大作中提到】
: primer问题吧
: 还有就是你这个蛋白主要是post－translation modification，和mRNA level水平关系
: 不大
:
: RNA
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v***a
发帖数: 1242 | 7 能再解释一下吗？不太明白为什么跟protein的degradation有关？我的这个protein不
应该supposed to be degraded啊
being
【在 A******y 的大作中提到】
: Protein stability changed? Something happened that the protein is not being
: degraded.
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O******e
发帖数: 4845 | 8 很明显，你的RNA extraction and RT没有过关，导致结果不稳定。找个人带你做一把
RNA提取，把protocol搞清楚再说别的。
RNA
【在 v***a 的大作中提到】
: 在做一个跟cell adhesion有关的蛋白，它在apoptosis中也会有作用。in vivo用IB看
: tissue中蛋白level的变化，可以看到在apoptosis的过程中该蛋白有一个瞬时的up-
: regulation（试了3个不同的抗体，结果都很consistent）；而当我从tissue中提取RNA
: 做RT-PCR，结果却十分不稳定（来自跟IB相同的animal，结果却都不一样，有的根本看
: 不到我要的gene，更别提看到induction了）。
: 后来就没理这个茬，接着往下做细胞培养了。现在做siRNA，发现in vitro也是蛋白有
: 变化，但用PCR提取培养的细胞中的RNA看的时候（用DNASE I处理过的），又断断续续
: 的，一会有gene一会又看不到gene（包括用control duplex及未处理的细胞）。看其它
: 的house-keeping gene都正常。
: 大家遇到过这种情况吗？按理说做siRNA，是不是在mRNA的level上的变化应该比蛋白多
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v***a
发帖数: 1242 | 9 我以前做其它的都挺好的。就这个gene怎么也不行。
可不可以请教一下你是怎么看RNA和RT-PCR好不好的？我一般是co-amplify S16，我的
S16在每组中都挺稳定的呀。。。PCR出来的S16亮度也基本一致。
【在 O******e 的大作中提到】
: 很明显，你的RNA extraction and RT没有过关，导致结果不稳定。找个人带你做一把
: RNA提取，把protocol搞清楚再说别的。
:
: RNA
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O******e
发帖数: 4845 | 10 S16含量那么高，只有mRNA的质量相当差的时候才会做不出来。
找个less abundant的基因试试你的RT-PCR.
【在 v***a 的大作中提到】
: 我以前做其它的都挺好的。就这个gene怎么也不行。
: 可不可以请教一下你是怎么看RNA和RT-PCR好不好的？我一般是co-amplify S16，我的
: S16在每组中都挺稳定的呀。。。PCR出来的S16亮度也基本一致。
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v***a
发帖数: 1242 | 11 好吧。。。
谢谢啦哈
【在 O******e 的大作中提到】
: S16含量那么高，只有mRNA的质量相当差的时候才会做不出来。
: 找个less abundant的基因试试你的RT-PCR.
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