w******e
发帖数: 1187 | 1 RNA有OD260，NTP也有OD260，那RNA被degrade的过程OD260会有改变吗？
如果没有的话，有什么其他好办法能不用run gel就看出RNA的integrity呢？
多谢！ |
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a***e
发帖数: 1010 | 2 if OD260/280 is bigger than 2.2, there is a possibility of degradation. |
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g***j
发帖数: 40861 | 3 I did gel extraction for PCR product, and then tested DNA concentration. But
the OD260/280 is very high, even to 8.0. What does it mean? |
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f*******r
发帖数: 36 | 4 各位大大，在下最近在成年小鼠颅骨中提RNA做real time PCR，碰到了很头疼的问题：
虽然产量不高，不过浓度和OD260/280看起来很正常，但是OD260/230 variation很大
，大都不到1.8，做内参18S波动也大到惨不忍睹。看看RNA的各项参数和18S的ct值，千
头万绪，看不出来什么东西影响了RNA的质量，或者RT-PCR。请帮忙出出主意，比如关
于提骨头totalRNA，做反转和real time PCR的trick，等等，跪谢！
ps 试剂部分，最近也有做细胞的提RNA》》real time PCR，看起来挺正常的，所以，
我个人觉得不是试剂的错儿。 |
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c*********d
发帖数: 9770 | 5 荒猫牛不耕微信号laoniu003005
功能介绍
好文分享
来源：荒猫之舞
作者：荒猫
中美贸易战告一段落，毫不意外地，咱们又赢了。不过与以往不同的是，这次美国也赢
了，是双赢。据报道，咱们答应了美国减少贸易逆差的要求，所以美国赢了；而因为要
减少贸易逆差，中方将大量增加自美购买商品和服务，这样可以满足咱们不断增长的消
费需求和促进高质量经济发展，所以咱们也赢了。
但让我感觉不可思议的是，这么好的事情，为什么一直不做呢？为什么要在美国政府的
逼迫下去做呢？是因为没有想到？那岂不是说那些人能力低下？是因为想到了而不做，
那岂不是证明了那些人很坏？
而且在美国高调启动贸易战之初，咱们是抱着多大的决心，宁为玉碎不为瓦全，一定要
打赢的，一定要粉碎美国人阻挡咱们大国崛起的阴谋的。当美国提出500亿的清单时，
咱们针锋相对；当美国提出1000亿的清单时，咱们继续应战；而当美国把清单的总价提
高到2000亿的时候，一夜之间，美国就不是阻挡咱们大国崛起，而是有利于咱们大国崛
起了。美国的要求原来是有利于咱们的发展，而不是遏制咱们的发展了。我恍然大悟：
原来以前的针锋相对，是用的激将法，是为了刺激美... 阅读全帖 |
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d*****r
发帖数: 2583 | 6 ☆─────────────────────────────────────☆
luojingjing (jingjing) 于 (Thu Jan 8 22:50:20 2009) 提到:
昨天送的，今天的数据一塌糊涂，说是测不了。
请问如何准备样品啊？
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ahche (啊且) 于 (Thu Jan 8 22:56:37 2009) 提到:
most of the time, the gel purified DNA is not clean enough. I always wash
twice with PE, and spin 2.5 min after PE. Then elute by H2O, and OD260
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luojingjing (jingjing) 于 (Thu Jan 8 23:09:03 2009) 提到:
我用QG洗了两次
PE洗了两次，每次还等了3-5分钟，
后来 |
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q**********0
发帖数: 335 | 7 Recenly I use T3 megascript do in vitro transcription. The results is always
bad, the OD260/280 is about 1.53. A big white pellet can be seen after
isopropanol precipitation and RNA concentratin measure is about 1.0 ug/ul.
However, when run a RNA gel, the band is very faint even using 5 uL. I don't
know why? Maybe there is protein contamination? or RNAse digestion? Please
help. Thanks a lot! |
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n********k
发帖数: 2818 | 8 rationale? I thought organic solvent could make it that or lower? so free
NTP has higher 260/280? |
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w******e
发帖数: 1187 | 9 ding. do you know of any easy way to assess RNA integrin? thx |
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T**********t
发帖数: 1604 | 10 看RNA degradation好像一般都是用agilent的bioanalyzer比较准，用量很少，结果快
而且直观，就是他家的chip和仪器比较finicky，操作起来要很小心，否则一点小纰漏
就废掉一块chip。
如果是细胞里提的总RNA，bioanalyzer的分析软件能给出RIN数据，叫RNA integrity
number，数字越低，RNA降解得越厉害。
但我估计你看的RNA是short RNA oligo library，可能不会有RIN吧，我没试过。但是
你的sample如果用analyzer跑一下，出来的结果可以像胶一样看，有没有degradation
应该很容易看到吧。只需要几分钟的时间，有条件的话，试试看吧。 |
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s***m
发帖数: 6197 | 11 看是什么样的degradation了
一般260/280不是很能说明问题
如果是cleavage的话，还是跑胶比较好
如果是降解成mononucleotide
跑个TLC plate，带正点的那种
理论上也可以吧
可能就是量要多一点 |
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h********n
发帖数: 4079 | 13 这个我以前用过, 很爽的.
degradation |
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a***e
发帖数: 1010 | 14 free NTP should >4, if my memory is right. |
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m****M
发帖数: 360 | 15 Of course not. I got perfect ratios of my RNA samples from nanodrop, but when
I checked them on bioanalyser, they were all degraded (around 7 or lower).
A simple example, you can get perfect ratio when you measure DNA primers. I
have done a lot RNA work, trust me or not? It depends on yourself. -:) |
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w******e
发帖数: 1187 | 16 which bioanalyzer do you use? 2100? I'm not sure if I can persuade my boss
to buy this. envy you guys:(
when
.
I |
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T**********t
发帖数: 1604 | 18 就是2100。我们实验室这台好久没人动了呢。:)
Bioanalyzer有很多应用啊。你们实验室开发microfluidics的，说不定可以借鉴一下，
或者在它的基础上开发点别的应用什么的，总之别跟他说你就是为了跑RNA看
degradation，不然他肯定让你自个儿跑个胶就完了。 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 19 agilent的bioanalyzer现在用的很多
的确又快用量又少
但是说白了其实也就是毛细管胶
一样是跑胶
一样是看rRNA的比例
没有这个条件的其实跑个琼脂糖电泳
照个照片
然后选择显示migrate/intensity
出来的图是一样一样的
只是没有人那样计算“RIN”而已
degradation |
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C*******e
发帖数: 4348 | 20 我手上现在没有RNA跑胶的照片
随便拿一个DNA跑胶的照片演示一下哈
Rf vs Intensity |
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s********n
发帖数: 2939 | 21 May have high contaminations like polysaccharides. You should check 230/260
also. |
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v***a
发帖数: 1242 | 22 may contaminated with RNA
But |
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w******a
发帖数: 1527 | 23 Check this one:
Reagents
* TRIzol from Invitrogen #15596-108.
* Mini RNeasy plus kit from Qiagen #74134.
* Phase lock gel from Eppendorf #2302830.
* Keep TRIzol at 4C.
* Use RNase-free tubes and tips for all steps.
* Prepare 70% ethanol using DEPC-H2O and keep it at -20C.
RNeasy plus kit contains a genomic DNA elimination column. It can replace
the DNase I digestion step of regular RNeasy kit.
1. Add 1.2 ml TRIzol reagent to cells/tissues (5~10X 106 cells/ml or 50~100
mg ... 阅读全帖 |
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z***x
发帖数: 80 | 24 I have no experience of isolating RNA from cartilage but need to do it soon.
Cartilage contains a lot of proteoglycans and glycosaminoglycans (GAGs). I
first homogenized cartilage into powders by freeze-milling. I then tried
guanidine and phenol to dissolve the cartilage powder but it was not quite
efficient. Most of the 100mg of cartilage powder was not dissolved in 2 ml
guanidine/phenol (Qiagen tissue lysis reagent).
The other question is that RNA and GAGs are both negatively charged polymers
... 阅读全帖 |
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s****a
发帖数: 454 | 25 首先非常感谢楼上几位的回复.
(1)取材的时候洗组织的液体里面加了CHX
(2)用了电动机子,上样了 1５,２０,２５,３０,３５,４０%的蔗糖梯度.
３８０００ｒｐｍ,２ｈｒｓ,SW41ti 转头.
(3)取样,电动的机子,20fractions,每个500ul,
(4)分光光度计读得OD260.
我做了个读数的曲线,大家帮分析下我标的对不对,那我收集polysome的箭头标记的准确
吗?
这两个分离实验只是在组织匀浆的时候方法不同,其他的都一样. |
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t*****z
发帖数: 1598 | 26 我用一般的琼脂糖凝胶跑RNA电泳，跑出来看着不错的，但是条带的大小和边上的DNA分
子量标准对不起来。我想可能是因为RNA分子的迁移率和DNA不一样，所以不能直接对照
。那么有没有公式可以把DNA分子量标准的条带换算成RNA的分子量呢？如果没有的话，
我是不是非得去买专为RNA设计的分子量标准呢？
另外，用反转录酶（Invitrogen SuperScript III）合成出来的cDNA，用OD260怎样定
量？是像DNA一样乘以50，还是乘以33或者别的什么因子吗？
多谢大家！ |
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e****p
发帖数: 354 | 28 请教SSCDNA TO DS CDNA 除了OD260 跑胶看看 有没有其他办法， |
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W*********n
发帖数: 775 | 29 PCR扩增出一个基因的片断，1200bp, 电泳，胶回收，连接到TA载体上，然后转化感受
态细菌，却得不到白色菌斑，都是蓝色载体自连的。
可能原因：
1）胶回收试剂盒大约1年半前买的，并被断断续续用过，是否过旧？但是QG buffer的
颜色没有变化，感觉应该没有问题
2）后来检测了一下胶回收后的DNA片断浓度和质量，浓度为15ng/ul,0D260/280=1.73,
OD260/230=0.03； 感觉浓度还可以，260/280也行，但是为何260/230那么低呢？ 看图
发现230处吸收特别高。这是什么原因？用的电泳胶不好，还是胶回收的试剂盒有问题？
3）用的载体连接是invitrogen的TOPO TA cloning kit, 感受态细菌也是他家的Top
10F. 载体是08年底的，有三年多了，会不会是时间久了自连的比较多？
大家分析下，问题出在哪里？ 全都换掉有些浪费。 |
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j***w
发帖数: 938 | 30 我刚做过同样的实验，但有几点不同于你的：
1: 直接用PCR product 做克隆，因为我做过很多cut clean的回收测序，要损失很多产
物，并且不纯。
2：你回收后的DNA有问题，OD260/230 太低了，你可以测测你的回收前pcr的产物浓度
，看看是不是也一样。
3：同时做阳性对照，可以看出是不是kit出了问题。
希望对你又参考
,
题？ |
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l**********1
发帖数: 5204 | 31 if that PCR mutation coincidencely happend on the key ponit or region of the
binding sites between that
probe and Genomic DNA sample, which is simialr to loss of docking site in
Western Blotting , then how can you expect both bind tightly unless p32 or
s35 etc isotope labelling can pick weak binging up but Dig labelling Can't
pick that kind of weak binging.
And after sub cloning that the slected white clone can keep your probe
almost no changed and inserted into that vector with LacZ gene of β-
... 阅读全帖 |
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k***g
发帖数: 4904 | 33 谢谢！请问怎么看出来是DNA？我倒是确实觉得OD260测浓度有点不像细菌
Strain Designations难道就是名称的意思，而不是bacterium strain的验证标准？
另外我是从bacteria & phages这个category搜索的，怎么会搜出来的是genomic DNA？ |
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D**R
发帖数: 371 | 34 最近做了一批RNA Extraciton，用NanoDrop测时碰到一个问题，大部分的RNA value都
在范围之内5-25 ng/ul，可是有两三个的samples值很高，超过200ng/ul，但是qPCR却
一点amplification也没有，那那个OD260 peak到底是什么东西呢？我们的是人的
sample，那些有bacterial contamination？怎么可以把它们去掉呢？多谢多谢 |
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D**R
发帖数: 371 | 35 多谢楼上两位，我倒也不是追究NanoDrop的准确性，关键是有两个(2/30)samples给了
两个实在是非常漂亮的peak at OD260，但是qPCR啥也没有，那种低得都测不准的
samples反倒是出来amplification了，所以我很困惑那么高的band到底是什么东西，
bioanalyzer也ran一下，觉得可能有些gDNA和RNA降解了，但关键这一批samples来自同
一个site，ralative speaking，这么高的peak会是从哪里来的。 |
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D**R
发帖数: 371 | 36 我做的是qRT-PCR，那些测出来NanoDrop很低值的sample都有amplification出来，唯独
这几个看起来Peak很漂亮，OD260值很高的啥也没有，所以我很困惑那都是些什么东西
，maybe contaminated with bacterial RNA? |
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