b*****1
发帖数: 17 | 1 还有一个问题就是
做human cell line和yeast有什么区别？
我感觉都是细胞吧。难度差不多吧？
这还是回到刚才那个问题。有前辈说做model organism难找到position，那做什么呢？
随便找个Hela Cell Line来做？（cell line不算model organism吧？）。。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 2 不是具体的分析啦。。。
像我刚才讲的那样，只是一个非常短的小结，或者引出下一个实验来用的句子。
一般是在几个相关的小数据之后才写一次第三点的。不是每一句都必须写。
比方说。
To test whether A possess binding affinity for B, co-immuneprecipitation of exogenously expressed A and B was performed in Hela cells. The results (as shown in Fig 1.A) suggest that A and B can pulldown each other in a reciprocal manner. Pulldown with endogenous A and B was also performed and the result is in well agreement with the former test (Fig 1.B). In order to test whether A binds to B directly, purifie |
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p*****m
发帖数: 7030 | 3 等明天brain research恢复了我给你贴个例子 呵呵
of exogenously expressed A and B was performed in Hela cells. The results (
as shown in Fig 1.A) suggest that A and B can pulldown each other in a
reciprocal manner. Pulldown wit
binding domain for B, which was not reported before and therefore need to
be elucidated here... |
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l*****7
发帖数: 153 | 4 请问sunnyday，有没有相关的资料可以学校这种八股文啊？ 谢谢啦 :)
另外我想知道怎么把包子发给你。
of exogenously expressed A and B was performed in Hela cells. The results
(as shown in Fig 1.A) suggest that A and B can pulldown each other in a
reciprocal manner. Pulldown with endogenous A and B was also performed and
the result is in well agreement with the former test (Fig 1.B). In order
to test whether A binds to B directly, purified protein A and B was used
in to
a binding domain for B, which was not reported before and therefore need |
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m**********e
发帖数: 1045 | 5 If it is?
How am I not be able to search the E3 from Pubmed?
I checked BCL-x in hela, the expression level is too low to detected, so
how can I use MG232 to find the smear ? (ubiquitination band?)
Thank, folks |
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c****y
发帖数: 14 | 6 Hi, zgrzfg (wushi),
You think that
1) high expression of your gene is toxic to cells and in long-tern culture
these cells gain growth disadvantage against those with lower expression,
and eventually will lost expression of transgene, even under selection
pressure;
Actually I cotransfect the plasmid and Hygromycin marker plasmid into
tetracyclin-inducible HeLa cell line and got stable cell line by selection
with hygromycin. I still didn't detect protein expressed by western blot in
such stable c |
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z****g
发帖数: 3340 | 7 If you don't have special preference to make a stable in HeLa cells, just
switch to 293 cells which is much
much easy for transfection, selection and colony picking.
also you can make some extra plates and check expression of your gene after
selection at different time
points. so you may get idea how is your transgene expression along with long
-term selection.
in
line? |
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j****g
发帖数: 406 | 8 我的经验是不同的cell line有不同的最合适的reagent。
293T, Hela用lipofectamine／2000效果很不错
NIH/3T3用RNAiMAX from invitrogen following the reverse protocol
N2a听说roche的X-tremeGENE不错
另外DHARMACON的1，2，3，4也有很多不同的最适合的cell line. |
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h*****y
发帖数: 10 | 9 最近用Hela检测APOPTOSIS，检测结果非常奇怪，我的阴性（没染）阳性（染凋亡细胞
）对照都很好，出峰正常，但我的待测样品，镜下很明显的非凋亡正常细胞，却也能在
凋亡区（10（1）--10（2））出峰，尽管跟凋亡样品比这个峰出的很扁平，但统计下来
APO细胞比率和凋亡样品一样无差别，我的细胞收集方法应该问题不大，用的是Sigma
dissociation soulution ，收集时吹打也很小心，所以现在我感到非常困惑，为什么
非凋亡样品也能出凋亡峰呢？哪位熟悉FACS ANEX5检测的牛人给指点指点，偶先谢过了
！ |
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z*******6
发帖数: 679 | 10 还在rotation选实验室，有个实验室蛮喜欢，方向什么的都还行，实验室宽松，有钱，
paper也还可以，能发个pnas，唯一感觉不放心的就是之前有篇pnas paper的数据有问
题，但不是他们故意的，发了之后才发现细胞系污染了，当初用的A549最后不知道怎么
变成Hela了，他们就当作A549发了paper。。。这种事情会不会被发现以后影响老板的
credit，对我以后影响也不好。。。
大家怎么说？
PS 主要还是觉得实验室有钱，花起来基本不用考虑的，前阵子就为要个带另一个抗性的pcdna，稍微做个克隆估计就出来了，或者borrow一下也不是多大的事，然后基本想都没想就从invitrogen上买了，500多刀，我看着就心疼，后来貌似就没用上。。。枪头什么的也都是买现成的带filter的。。。我以前呆过没钱的国内实验室，做起实验来真郁闷，所以了。。。
另外就是课题比较吸引我，刚拿到的一个R01做HIV的，貌似用他们的系统有希望搞定HIV似的，不小心激发了我的一点点野心。。。 |
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s*******w
发帖数: 1879 | 11 为什么啊？
那怎么测细胞有没有被污染呈hela呢？ |
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c**a
发帖数: 94 | 12 遇到高手了,讨教一下. 我用的是HDAC6, 从 Enzo 买的, 拿来做tubulin deAc, 这个在
2002的paper
中就show过了, 但是我做死都做不出来. 到底是买的protein失活了,还是反应需要特殊
的条件? 也
试过用Hela nuclear extract 加purified Histone, 也做不出来. 请高手明示. 另外,
你说的 TFA
substrate是什么?
most
though. |
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A******y
发帖数: 2041 | 13 What's your substrate? Are you using Enzo substrate? If your hela cell
extract didn't work, don't expect the HDAC6 to work.
Check your pH...should be 8
Do the incubation at room temp first.
HDAC6 is fragile...I will get them from BPSbiosciences.
Go buy a tube of Boc-Lys(ac)-AMC from Bachem or Anaspec and make the
substrate youself in DMSO...
watch your %DMSO...more than 1% in the reaction mix will not work (yea, I
know someone say they have 5%...sure)...
If you are trying to deacetylate isolat... 阅读全帖 |
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s******y
发帖数: 28562 | 14 晕，这也太奇怪了！
我们和隔壁实验室用的是HEK293T， MEF， HEla， 真的就是一点都没有用！
但是这个药品不应该挑细胞系的，而且我以前用的时候一直好好的，那三个细胞系都可以
的，就是这个新来的药品突然一下子就不能用了 |
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n******u
发帖数: 418 | 18 最近准备开展个新课题，做了一些priliminary的实验
在HeLa cell里面kd了一个gene后发现E-cad的表达明显降低了
所以怀疑这个gene可能在EMT里起作用。所以我想问下这里做过EMT的，你们一般用什么
cell line作
为model做类似课题？似乎epithilial cell是一个比较合适的model，大家有什么推荐
的cell
line么？谢谢了 |
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S******e
发帖数: 393 | 19 cDNA加载体约20kb, 转染Hela, 293, U2OS, 我试了lipfectamine2000, 效率很低，表
达及其微弱，请问有人转过大质粒吗? 除了电转外有好的方法吗？ 多谢！ |
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m******5
发帖数: 1383 | 20 你用的什么cell line? Hela好像特别容易进核，换NIH3T3或者293T试一下
不过楼主你做这个NES的目的是干嘛？ |
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S******e
发帖数: 393 | 21 Hela, U2OS
用的lipofectamine RNAiMAX |
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b*******H
发帖数: 830 | 22 也跟细胞有关系吧。象HELA细胞已经被抑制得很低了。但也能做出来。 |
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q*****n
发帖数: 331 | 24 Why not make it yourself?
There are so many protocols online about how to make nuclear extract from
cell lines.
Co-IP may need a lot of lysates (mg scale). Purchased lysates are normally
in small quantity ( a few hundred ug). |
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g*********5
发帖数: 2533 | 25 thank you. and 1mg for $235 from Biovision? |
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a*******u
发帖数: 19 | 26 A-CFP和B-YFP（或B-CFP&A-YFP）共转HEK293T，COS7，使用lipofectamine 2000转染（
按说明书操作）48小时后，细胞中只有A-CFP或B-YFP，但是没有2个蛋白一起表达的细
胞。A在80 kD左右，B在90kD左右，是不是A和B蛋白太大，两个不容易一起表达？如果
将用A的剪切体约45kD再和B全长去做FRET估计能共表达吗？
Hela里共转Flag-A和His-myc-B的时候A表达很低，所以就没试；293T和COS7中Flag-A和
His-myc-B共转都没问题。 |
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i*****g
发帖数: 11893 | 27 很有意思，看见这么多人在说这个想法。
这个想法我在2005年1月之前，换实验室时，和PI说了，他听不懂这张PPT意味什么。
后来我又换了实验室，2007年（2008？）某天新老板和我听完某个不相关的seminar，
和我说起这个，他才开口说了2句，我就知道他想说什么，
他的反应是，i have not finished my briefing yet, you really understand my
point? 于是就和他说，of course i know what you want to do,然后讨论了半天，原
来他的朋友有这个想法 etc etc，后来我又做了一些Homework，还是决定放弃。这个很
不好做，估计是个死途。
这个技术最大意义是：能找到locus specific DNA-protein complexes。目前的通行做
法是，已知某个protein, 你用CHIP，证明在某个Locus上面，然后开始making story，
编剧。但其实，那个Locus上面可能有几十种特殊蛋白在调控！！！
2004年底，我的想法来源于推广TAP+MS，我已知 TAP+MS... 阅读全帖 |
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e**o
发帖数: 345 | 28 发现我的蛋白不在hela里表达 （WB 没有band， fibroblasts band 很强）。很奇怪，理论上缺了这个蛋白细胞应该活不下去啊。 我们不
是做cancer的， 接着往下应该怎么做? |
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s******y
发帖数: 28562 | 29 有一定搞头。
首先，先用其他方法确定那个蛋白真的不表达。
然后，可以从fibroblasts入手，看看把那个蛋白给KO/KD后有什么后果，
然后，如果把那个蛋白给hela补上去又如何。再然后，可以做很多有关这个蛋白功能的
实验。
第三，和搞癌症的人合作，看看这个蛋白在癌症病例里面是否涉及。
，理论上缺了这个蛋白细胞应该活不下去啊。 我们不 |
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e**o
发帖数: 345 | 30 谢谢各位。
还是想先在细胞里再测试一下。 准备多找几个cancer cell lines 试再检测一下。 问
题是正常的对照不好找。 比如hela 到哪里找control呢？
同时准备找个做cancer的MD 要几个samples。 |
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e**o
发帖数: 345 | 31 做个表达lenti V， 用hela做softagar，看看有没有变化。 |
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t******y
发帖数: 716 | 32 HeLa cell expressing a truncated ER protein. |
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s******y
发帖数: 28562 | 33 如果你要转的是类似Hela, HEK293T 这些大众化的细胞的话，
我亲手做过，用lipofectamine能转。如果你担心内毒素的话，
在做miniprep 的时候额外多洗两次（一次用buffer PB,
然后70%ETOH 洗的这一步多洗一次）
唯一要注意的是大部分mini-prep 出来的质粒浓度比较低，
如果浓度太低（低于50ng/ul) 的话要浓缩。
和线性，而maxi的去除了内毒素，且 |
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j****x
发帖数: 1704 | 34 个人的经验，我手头的大部分普通细胞系（Hela，293/FT，BHK，HepG2，Huh7，vero，
CHO...）在-80度存半年以上，复苏效果会大大的打折扣，超过1年的，基本就惨不忍睹了 |
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t******y
发帖数: 716 | 36 HeLas cell 和U2OS细胞形态比较好，比较适合用于显微镜拍照。 |
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p*********r
发帖数: 99 | 37 版上有人做 ribonucleoprotein immunoprecipitaion (RIP)成功的吗？ 我用Hela细胞
系, Rabbit IgG 和 Protein-G 磁珠 试了几次IP都有非特异的RNA随洗下来。例如
Actin. 求教高人指点成功要点. 谢谢! |
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O******e
发帖数: 4845 | 38 两码事。
我要告诉你的是，一个领域或者一个分支学科包含很多层次的研究，就像做aging的，
很多实验室根本就是拿HeLa细胞来做模型。照你的说法，这个差得更远－－但这不妨碍
他们对衰老研究的贡献。同理适用于早衰的动物模型。
至于用什么来治疗某种疾病，那根本就是另外一个话题。我从来不奢谈自己的研究会
治病。做基础研究的，最根本的任务还是探索未知提供知识积累。 |
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O******e
发帖数: 4845 | 39 两码事。
我要告诉你的是，一个领域或者一个分支学科包含很多层次的研究，就像做aging的，
很多实验室根本就是拿HeLa细胞来做模型。照你的说法，这个差得更远－－但这不妨碍
他们对衰老研究的贡献。同理适用于早衰的动物模型。
至于用什么来治疗某种疾病，那根本就是另外一个话题。我从来不奢谈自己的研究会
治病。做基础研究的，最根本的任务还是探索未知提供知识积累。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 40 细胞很容易污染的。被细菌污染或者被其他细胞污染。如果你们就是养点
hela做biochem，随便养养估计没事 |
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m**********d
发帖数: 137 | 41 想问问这几个line对于 TGF-beta的反应怎么样 |
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e**r
发帖数: 1144 | 42 CHO K1细胞，前一天用150uM H2O2处理过，养了一天，大部分细胞漂起来了，剩下贴壁
的细胞在相差显微镜下看大部分都有两团亮的东西在核的两侧
之前也看到过一次这种东西，那次是因为在DMEM里养了几天，大概是因为没有proline,
所有细胞都变成了这个样子。换成F12养了一天就恢复正常形态了。
谁知道这种亮的东西是什么结构？ 低倍用眼睛看似乎是一些小泡构成的簇
Hela, 293T上没见过这种东西。 |
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a****k
发帖数: 1130 | 43 HT29 cell: TNF-α + Smac mimetic + z-VAD-fmk
FADD null human T cell leukemia Jurkat cells: TNF-α
HeLa cell: ectopic expression of RIP3 + knock down caspase-8 + TNF-α +
Smac mimetic
etc......... |
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S*********s
发帖数: 304 | 44 师妹，你太牛了，这个你都懂~
Hela cell不用knockdown caspase8，用zVAD就行 |
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e**r
发帖数: 1144 | 45 hela
lipo转染后12小时看还是好的
用培养基换掉后又过了12小时，发现大部分细胞都死了，死掉的细胞大部分仍然贴壁保
持梭形，部分漂起来的也是扁平梭形的 |
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q**********0
发帖数: 335 | 46 Which cell line is good on the study of cell cycling and cancer? NIH3T3,
Hela, HepG2 or Huh 7? Thanks a lot! |
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l******g
发帖数: 1145 | 47 Rb-E2F pathways 用HeLa的不少,还有用T98G的——和我专业无关，只是qualify考试时
写这个题目，念了些文章。 |
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c*****n
发帖数: 233 | 48 total rna是用hela提的。第一列的sample是G0的细胞，第二列是用double thymidine
同步得到的mitosis的细胞。 |
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u**********d
发帖数: 573 | 49 re
既然是HeLa，材料肯定便宜啦，吸取上清的时候少吸血嘛，取1/2甚至更少都可以，RNA
浓度降低一些，但不会到一个数量级，绝对够用。
碰到那个位置的时侯 |
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e**r
发帖数: 1144 | 50 Hela之类传了很多年的细胞系
与最初分离时相比是不是会有很多突变？ |
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