d**********t
发帖数: 20415 | 1 这个293T吧，293感觉还是挺难晃下来的，lz这个应该和trypsin没啥关系
flushed |
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d**********t
发帖数: 20415 | 2 你试了几管都这样么？
看看你放细胞的液氮罐液氮level怎么样，我知道有实验室液氮没有及时灌，上面的细
胞都远远高于液氮了，好多细胞都复苏不出来
有2 |
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T****u
发帖数: 424 | 3 支原体。
买点抗支原体的chemical杀几次。
可以PCR检测一下。
有2 |
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C******2
发帖数: 97 | 4 something is wrong with your DMSO. |
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s******r
发帖数: 1245 | 5 293我都懒得放液氮罐里，扔-80度一年多了化开还都长的好好的 |
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a**********2
发帖数: 28 | 6 谢谢楼上各位的comments!
- mycoplasma: 把最新1月份冻下的vial送去检测，没问题；昨天把刚刚在culture里死
掉的细胞又送去了，还没拿到结果；
- 液氮:应该不会，实验室的液氮罐还是维护的不错的；
- 我的具体cell line是Flp-In™ T-REx™ 293, invitrogen的，非常容易
脱离plate，还很敏感：density太低会不爽；incubator水不足了会马上不爽；拿到
incubator超过15分钟也会不爽。总感觉这293没有传说中那么容易操作。。。也许最基
本的方面就有问题？ |
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V******t
发帖数: 444 | 7 楼主我遇到过和你一样的问题，就是一是trypsin消化后，都成细条条、纤维状；二是
上次分过后，长得好好的，轻轻一晃就飘起来，成纤维状。
原因不明。我是重新弄了新的，重新保存。我检测过，没有支原体，也不是冻存的原因
，也不是培养基，也不是trypsin。很奇怪。希望楼主能搞清楚。
有2 |
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s******s
发帖数: 13035 | 9 293就是这样的，很容易不爽。不过一般不爽就是产病毒效率低，
全飘起来比较少 |
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r******k
发帖数: 446 | 10 我也碰到了一些问题 复苏的再passage 就不行了 总是还没长满就开始 变成
multilayer！ 好烦呀！ |
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h*****n
发帖数: 47 | 12 请教克隆大牛和电生理大牛，现在要研究一种叫hERG的钾通道在 HEK293 细胞上的表达
，把这个hERG转到哪种vector 上表达强呢？为了以后做电生理记录的电流可以大点。
除了pcDNA3，还有在HEK上表达好的载体吗？pcDNA 的话，是3.1比3.0更好吗？大牛见
笑，穷人，所有家当16个包子奉上！ |
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d*****r
发帖数: 45 | 13 不是大牛
pcDNA 完全可以，你也可以试试vectors with CAG promoter，理论上表达更强.
另外，你可能要先make sure HEK293 里有没有内源性的potassium currents ， 会不
会干扰hERG currents. |
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r******g
发帖数: 600 | 14 http://pnabio.com/products/KOCells.htm
你们看
Cell lines that we have generated knock-outs or knock-ins
HEK293 cells
HeLa cells (hypertriploid)
SKBR3 cells (hypertriploid)
HCT116 cells (diploid)
MCF7 cells (Hypotriploid)
K562 cells (hypotriploid)
CHO cells
NIH3T3 cells
We have successfully generated knock-out clones up to 4 copies in one round.
应该不难做吧
成功率应该不低，好想自己试一下 |
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y*******g
发帖数: 4 | 15 Postdoctoral Research Fellow Position in Institute of Glycomics, Griffith
University, Gold Coast, Australia
Prof Yaoqi Zhou’s group http://sparks-lab.org is built up a strong term for his molecular biology laboratory to interact with his computational laboratory at the Institute for Glycomics, Griffith University, Gold Coast, Australia. Initial exciting discovery in protein expression optimisation, antibiotic inhibitor discovery and protein design leads to the current expansion of the team. We... 阅读全帖 |
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d****h
发帖数: 46 | 16 主要说了胎盘性硫酸软骨素（PL-CSA)是普适性的肿瘤标记，改造的疟疾蛋白能特异性
的识别这种pl-CSA，介导药物的投递，杀死肿瘤。
初略读了一下，感觉数据很扎实，多中心的研究，应该是可信的。
如果结果被其他的实验室验证的话，这将会引起肿瘤治疗的革命，可能是既格列卫后肿
瘤领域最重要的进展了。
不过不明白的是非肿瘤细胞HEK293表达18个基因后获得了pl-CSA，正常的细胞（应该也
部分表达这18个基因）却没有pl-CSA。 |
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f******r
发帖数: 96 | 17 Hi, I agree. For transient transfection, Cas9 never reached 80,90% in HEK293
. And the efficiency is much worse in stem cells. But I guess the Virus-
based delivery will greatly increase the gene editing efficiency. |
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s*****i
发帖数: 315 | 18 I don't think this is true.
The efficiency is really cell line - dependent.
I recently had targeted mouse ES cells with HR events over 40%.
HEK293 |
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n**********g
发帖数: 196 | 19 这人的帖子正说明了韩文章的费解之处（甚至说是不合理之处），因为转入质粒后，尤
其是HEK293这种会扩增质粒的cell line，蛋白会持续表达至少数天，没有道理晚转染
ssODN几小时到24小时就不work。
令，如果没读过三遍韩文的就不要发言评论，那么这里我猜会是清一色的质疑文章。 |
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i***9
发帖数: 106 | 20 顶一下，有多少人知道pcDNA3.1或者pEGFP-N1等含有SV40 origin的质粒会在HEK293里
面自行扩增的？算是普及知识面。 |
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m****a
发帖数: 270 | 21 HEK293 不会，293T 和Cos 7 会，质粒里的SV40 enhancer 需要 SV40 large T
antigen 结合才能起作用，这个在293T 和Cos 7有表达。 |
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m****a
发帖数: 270 | 22 更正一下你的最后一句话
Georg Nagel 2013年的PNAS 已经将ChR2 表达在了 HEK293 ,BHK 和 oocyte。
就差神经元和在体了。
搞不懂为啥德国人当年要和Karl合作，找一个会做神经元培养的，不马上就能搞定的事
情。
......
至少Deisseroth和Boyden不能说他们是最先把ChR2用到mamalian cell上的了，只能说
“之一”。 |
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发帖数: 1 | 23 技术重复是看你操作有没有失误；生物重复是看你实验本身（这里是细胞）有没有有统
计意义的差异。
[在 flareon () 的大作中提到：]
:最近做luciferase assay，就是把含有疾病相关的snp的promoter跟luciferase连接在
:一起，看snp对promoter的影响。假设snp的ref allele是A, 疾病相关的allele是B
:我首先在hek293里做，用lipofectamine3000转染。铺板子（12-well）铺了10个孔，5
:个用于allele-a, 5个用于allele－b。先把lipo和dna混合好，然后把mix分给每一个
孔。
:以上是第一次实验，过两天我会一模一样的重复上述实验。
:我想请问这里的5个孔中的每一个孔算是biological replicate还是technical
:replicate呢？
:而这两次实验算是biological replicate还是technical replicate呢？
:之所以问这个问题是因为后来面对转染neuron的实验。neuron比较难转染所以用的是
:nucleofection... 阅读全帖 |
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s******s
发帖数: 13035 | 24 这个biological和technical的不过是为了区分方便而已，没啥实际意义，
需要你纠结的时候，就说明这种提法不够准确了。
其实考虑这些问题非常的直接，你的统计学结论的scope是什么。你一次
铺5个，最后能做出的结论就是“9月12日我的实验结果说明a和b不一样“；
你第二天再搞一次，结论就是”9月12日和13日的实验结果说明a和b不一样“。
其实你想要的结论是“a和b不一样”，你所有的实验都没法推出这个结果，
你从前面两个实验的结果来推，这叫做extrapolation. 要注意，extrapolation
都是不靠谱的，当然你做两次试验比只做一次相对靠谱一点。至于啥biological/
technical都没啥区别，你第一次的实验想对mix好了测5次也算是biological，
你第二次试验相对于重新买一批hek293重做也算technical, 程度不同而已
5
孔。 |
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发帖数: 1 | 25 "...combinant α-syn is directly phosphorylated by cell lysates
overexpressing LRRK2 from HEK293 cells [99], while there is no evidence that
LRRK2 causes increased α-syn phosphorylation in cell or animal sy..." |
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