W*******n
发帖数: 2762 | 1 sunnyday, How about HEK 293 cell? I have one Protein secreted from this line
, 6-His taged, but expression low. |
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f*******d
发帖数: 92 | 4 别这么费劲弄清楚你的细胞为啥子死了，直接去ATCC再买一管新的HEK好了。 |
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f*******d
发帖数: 92 | 5 别这么费劲弄清楚你的细胞为啥子死了，直接去ATCC再买一管新的HEK好了。 |
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i***l
发帖数: 1656 | 6 100Aa 不短了 完全可以体外表达春花
原核还是真和或者古细菌的？ 原核用原核系统 真和就用真和系统比如酵母，HEk，昆
虫杆状病毒等等 古细菌大概就用Ecoli就好了
如果是从稀奇古怪的物种来的，可能AT高或GC高，需要先做ORF 优化
少。 |
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m****e
发帖数: 173 | 7 49,000 x g for 90 min
拿到hek，周一分细胞，周二transfection,周四离心，周五分装。然后就可以用了 |
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U**l
发帖数: 153 | 8 同问。不过看到是抗体，不知是否是这个原因
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7 |
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s**a
发帖数: 2138 | 10 真的还是吹？ transient, 即使最容易的mAb也不容易到150mg/L吧？ |
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j*****q
发帖数: 82 | 11 50--300mg/l的范围。这个吹了有好处吗？
我做不出东西也收不到你钱啊 |
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b******y
发帖数: 627 | 12 Start with protein sequence or needs plasmid? If plasmids are required,
which vector(s) should the genes be in?
If price is reasonable, there will be a lot of need. I have three proteins
requiring such service. |
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j*****q
发帖数: 82 | 13 Can start with AA or DNA sequence or plasmid. GOI will be cloned into in
house vectors.
For quotation, pls PM. Price should be very compectitive. |
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h*****n
发帖数: 47 | 15 请教克隆大牛和电生理大牛，现在要研究一种叫hERG的钾通道在 HEK293 细胞上的表达
，把这个hERG转到哪种vector 上表达强呢？为了以后做电生理记录的电流可以大点。
除了pcDNA3，还有在HEK上表达好的载体吗？pcDNA 的话，是3.1比3.0更好吗？大牛见
笑，穷人，所有家当16个包子奉上！ |
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i***R
发帖数: 663 | 16 开会闲聊听一个做Mechanosensitive channel 的教授说他似乎能重复小保方的实验。
HEK cell 怎么挤压，stretch 一下，就表达pluripotent marker 了。 |
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H**T
发帖数: 3007 | 17 见谢灿当时的情况说明（http://www.zhihu.com/question/35675234），电子邮件附件显示鲁白实验室的博士生褚鹏程在2015年1月8日给谢灿的电子邮件中写道“以便我们决定是不是要做一些磁感应相关的神经研究”，显然是说鲁白和他实验室的成员想做这个蛋白磁感应相关的神经研究，而这正是张生家发表的文章中所做的研究-转染HEK-293细胞强加磁场实验、海马神经元钳夹实验。 |
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s*******e
发帖数: 1389 | 18 任何一个和铁结合的蛋白，我都可以说它是一个“磁受体”。
MagR是不是“真的磁受体”，关键在于这个蛋白对动物的“磁感应能力”是不是必要的
。而这种感应能力，是神经行为，意识层面的现象。没有体内的功能实验，谁也不知道
MagR是不是“真的磁受体”。
张生家的文章的着眼点不在于动物的磁场感应能力，而是MagR能否在操纵外加磁场的条
件下改变细胞的活动状态。所以他一直说自己做的和谢灿做的没关系。也确实如他所说。
张生家的data如果是真的，我觉得他的文章的新颖性非常高，比谢灿的这篇文章还要好
。因为我读了谢灿的文章，想不到人的MagR转染HEK-293细胞在外加磁场的条件下可以
引起calcium influx。能用外加磁场改变细胞活动状态是很重要的发现，这个我是承认
的。
我对张生家的意见有两点：一是张生家的data有可能不consistent，拿到的图就做出过
来一次或几次。大家不能重复的话张生家就丢人丢到姥姥家了。二是没有经过谢灿的允
许就先行发表，而且是恶意的，不经peer review的抢先发表。还说谢灿没贡献，MagR
是一个已知蛋白，这种把大家当傻子的行为无论受了多大的委屈都是... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 19 #注明译者，请随便转载：）
CRISPR英雄谱
埃里克・兰德（Eric Lander）
小鹿／译
三年之前，科学家们宣布，CRISPR技术能够对真核活细胞进行精准与有效的基因组编辑
。自此，这项技术手段已然震撼了科学界，数以千计的实验室正在将其运用于从生物医
药到农业的各个领域。然而，从一种奇特的细菌重复序列现象的发现开始，到确认这种
现象为适应性免疫系统，进而对它的生物功能特性的了解，直至开发为一项基因工程的
技术，这此前二十载相关的研究历程却不为人所知。本文正是着眼于填补这段科学历史
的空白，它讲述的是观念的演化历史和先锋人物的传奇故事，并且从中获得关于支撑科
学发现的优秀科研环境的启迪。
前言
很难想起曾经有哪一次科学革命像CRISPR这般如此迅速地改变生物学界。仅仅三年之前
，科学家宣布，CRISPR系统，即细菌通过纪录和精准攻击入侵病毒的DNA序列而进行自
身防御的适应性免疫系统，可以利用转化为一项简单而有效的技术在哺乳动物和其它生
物体的活体细胞内进行基因组编辑。CRISPR即此被全球数以千计的实验室运用于广泛的
领域，如创建人类遗传疾病和癌症的复杂动物模型；... 阅读全帖 |
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c**i
发帖数: 265 | 20 codon optimization 从真核到原核是必要的，从原核到真核不必要。像HEK这种各种
tRNA都很多，没必要，特别在年均实验经费3万，各种variants都靠PCR from strain的
情况下。 |
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c**i
发帖数: 265 | 21 我相信这个实验是可以重复的，但这些所谓的技巧也太初级了吧。用的是HEK 293又不
是什么特殊的cell line， 现在的PCR酶和buffer根本不用考虑二聚体的问题。
“所谓高超的技巧，其实也很简单，细胞做好检测，不要有寄生菌污染，不要有支原
体污染” “对于Fig4，也是几乎惟一算是有难度的，就是控制转染时的细胞密度和用
血清控制细胞生长，时间稍长，毕竟NgAgo未经过系统的密码子优化” "小经验，PCR最
好不要有引物二聚体，如果引物二聚体多请重设引物“ |
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发帖数: 1 | 22 For those who can not access the link
I copied the content here:
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
NgAgo
15 posts by 9 authors
Davide Seruggia
Jun 23
Hi,
I tried a couple of transfections with the NgAgo plasmid from Addgene and
the 5'P oligo against GFP from the paper, but I did not see a dramatic
reduction in GFP+ as seen using Cas9 and a GFP sgRNA.
Anybody tried as well and came to the same (dead) end?
Davide
k*****[email protected]
Jun 24
Hi, Davide,
I tried th... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 23 From Google 网上论坛
Michael Wilson
2016-07-15 16:54（1 分钟前）
将帖子翻译为中文
Hello,
We have twice attempted to test the NgAgO addgene plasmid in HEK 293 cells
using lipofectamine transfection and the EGXXFP split reporter assay. As
many are aware, this assay requires DNA cleavage in the EGXXFP plasmid to
restore GFP expression.
We ordered oligos with 5' phosphorylation and transfected directly or PNK-
treated an aliquot prior to transfection, just to ensure 5' phosphorylation;
neither of these methods ... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 24 最近做一个DNA damage的实验，就是用H2O2来诱导Hek细胞基因组oxidative damage；
然后用FPG这种能识别8-oxoG的酶来切，被切的基因组位点会产生nick，阻碍PCR
polymerase，基于这样的原理做qPCR定量来研究某段序列对于oxidative damage的反
应。
好像这种做法比较少见，大部分DNA damage的研究都是global的。但也有很好的先例比
如：
http://www.nature.com/nature/journal/v429/n6994/abs/nature02661.html
这篇经典的Nature 文章
我按照这篇文章的做法，把genomic DNA进行FPG overnight digestion （DNA+FPG+Neb
buffer+BSA），同时也做了mock control（DNA+水+Neb buffer+BSA），然后qPCR发现
Ct如下：
DNA：25
DNA+FPG+buffer：28
DNA+水+buffer： 28
让我惊讶的是，相比于纯DNA，mock control的DNA+水+buffe... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 25 并无牛B轰轰，只是说点自己观察到的看法。
而且忠言逆耳。
那些妄想搞搞计算omics就可以混的跟shirley liu一样的年代已经一去不复返了；还有
那些研究搞个什么epigenetics map就可以硬跟disease扯上关系然后就觉得可以分到
funding的要注意了。搞omics的哪个不是无数合作，绑牛人大腿，为别人做嫁衣裳，无
数政治斗争的？
不管如何，真是厌倦了在HEK cell里搞点map，调控下基因然后就声称跟disease有关的
研究了。research也是经济，也是市场，也要需求，现在的风向明显变了，要真正的
translational research，治疗疾病，造福社会，过去骗骗钱的日子一去不复返了。 |
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发帖数: 1 | 26 并无牛B轰轰，只是说点自己观察到的看法。
而且忠言逆耳。
那些妄想搞搞计算omics就可以混的跟shirley liu一样的年代已经一去不复返了；还有
那些研究搞个什么epigenetics map就可以硬跟disease扯上关系然后就觉得可以分到
funding的要注意了。搞omics的哪个不是无数合作，绑牛人大腿，为别人做嫁衣裳，无
数政治斗争的？
不管如何，真是厌倦了在HEK cell里搞点map，调控下基因然后就声称跟disease有关的
研究了。research也是经济，也是市场，也要需求，现在的风向明显变了，要真正的
translational research，治疗疾病，造福社会，过去骗骗钱的日子一去不复返了。 |
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b****y
发帖数: 267 | 27 HEK cells. Most labs and companies have those over expressed cell lines.
请问做ADME/Tox的同仁，有没有好的in vitro细胞模型具有高表达的OAT1, OAT3, OCT2
等肾脏特异的Transporter?
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b****y
发帖数: 267 | 28 So far, not a good model is available for this purpose.
Although the HEK/OATs over-expressing cells can be used to study drug uptake
, they do no........
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d********r
发帖数: 3279 | 29 no way. there is almost no background currents in HEK cells. You must did
something wrong on your recording setting. |
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h*******g
发帖数: 711 | 30
HEK cells. You must did
I know there couldn't be. Nobody shows a big current
in any paper. However, it is the case at least in our
cell-line....... |
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h*******g
发帖数: 711 | 31
】
figure out.
current in blank HEK cell.
easiest way is to get some
First, I would like to thank you for your good
advice. I have used NMDG+ MSA solution. However, the
current is still there, which is really wired.
Anyway, we have ordered a new line from ATCC. Hope
this can solve the problem. |
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l******8
发帖数: 1691 | 32 That's very confusing.HEK cell should not behave like this.Most likely there
is something wrong in the setting, not in the cell line.
First of all, you said the Vr is < -40 mV, assuming the Vr is -50 mV, so, at
-50 mV, you have 0 current, right? Then, at what holding voltage did you
get a -10 nA current? You said this is the background current, so I assume
it is not depolarized.
What is your noise level (peak to peak)? Also, it would be helpful to know
your depolarizing step size during membrane... 阅读全帖 |
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a*****h
发帖数: 484 | 33 也许我们已经遇到了人生中最宝贵的投资机会，很多人的账户在过去数月中已经翻了数
倍，而且眼下种种迹象显示美国经济已经开始复苏，这是否意味着三月开始的反弹其实是一
个大牛市的开端呢？
作为一只小青蛙，有幸经历了去年的大熊市，和之后的短暂反弹，以及今年年初的暴跌
以及之后的强劲回升，实在是打开眼界。看到自己的账户一度缩水至仅剩45%（作为青
蛙是何等心痛啊!!!那时候才体会到什么叫做“股市有风险，投资需谨慎”）,到如今的
250%（体会到“不经历风雨怎么见彩虹”）,不禁感慨万千。后悔过自己由于经验不足
而错过类似car,dtg,hig这样接近10×的机会，而都只是捞了一小漂水就跑；也经历过
由于跟风买入的sorc,sil的破产而导致小分队全军覆没；当然也有过成功的抓住ainv,
lvs等疯狂上涨波段的经历。个人感觉目前的股市还有类似这样的n×的机遇，所以抛砖
引玉，在这里列出我watchlist上的candidate，供大家参考。从胡同的xxtrader老大学
到很多东西，下面的匹克有些来自他的推荐，有些是网友推荐而个人感觉很好的，有些是根据个人的观察觉得有料的，或者是随时有可能喷发的FDA... 阅读全帖 |
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N***i
发帖数: 2063 | 34 【 以下文字转载自 Stock 讨论区 】
发信人: ll111 (Stealth), 信区: Stock
标 题: Events and ERs for week Aug 9-13
发信站: BBS 未名空间站 (Sat Aug 7 22:26:20 2010, 美东)
Monday, Aug. 9
Scheduled for around noon: President Obama to deliver remarks at University
of Texas in Austin.
No data scheduled.
Tuesday, Aug. 10
House returns for one day to vote on state aid bill.
9 a.m.: Federal Reserve's Federal Open Market Committee meets on interest
rate and monetary policy. Statement to be released at 2:15 p.m., at Fed
headquarters.
8... 阅读全帖 |
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m*********k
发帖数: 10521 | 35 ID：
Javacell
leewalk
wowowowo
zdt08
Faithbee
niurougan
idlewind
xiximama
lonelywolf
Melody0131
chinabbsboy
Taliban
Hek
kungfupanda
palmbaby
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