c*******7
发帖数: 28 | 1 在尝试用FACS区分表达EGFP／RFP的两种细胞,希望最后能统计出两者的ratio
但是奇怪的是,EGFP在FL1,FL2两个通道的分布几乎完全相同,不能区分
用的是pEGFP-C1载体,EGFP在N端,无插入序列,共聚焦显微镜下表达正常,用红色荧光通
道无法检测到
转293T cell，没有做任何固定,仅用PBS重悬
同时看了RFP或者mcherry,就可以用FL2通道检测,在FL1上信号很弱,可以区分出来
想问一下大家有没有遇到这样的情况?这是质粒本身的问题还是机器调试的问题? |
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Z******5
发帖数: 435 | 2 听说EGFP观察更容易，不需要加底物。但问题是需要激发光，老鼠的自发荧光会有干扰
。虽然EGFP灵敏度比Luciferase高，但是有本底的干扰导致实际灵敏度还不如
Luciferase。
Luciferase好处是可以定量，不受自发荧光干扰。但是观察前需要腹腔或者血液注射底
物。据说灵敏度可以达到100个细胞，然后随着距离体表的深度每增加0.5cm，检测的灵
敏度升高一个数量级的细胞数。
两者可以说各有优缺点。总体感觉luciferase可能更好。但是发表出来的论文中貌似转
基因的多数都是EGFP标记，而luciferase大多是用来标记打入老鼠的外源肿瘤细胞。
这方面没啥经验，请有经验的朋友给个建议。 |
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m*****s
发帖数: 2227 | 3 最近要用eGFP的抗体来做IHC
想知道eGFP抗体的童鞋都是从哪里订的, work well？ |
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c*******7
发帖数: 28 | 4 我说的就是单荧光的control，还没有把两种荧光混起来。
我把RFP和EGFP的结果上传了。EGFP那张图最后用FL1,FL2作为纵横坐标作图,结果就几
乎是一条直线。
机器是BD FACSCalibur Flow Cytometry System |
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C*******e
发帖数: 4348 | 5 加linker了么？
会不会后面EGFP没折叠好
做了别的实验验证的确有EGFP fusion protein表达么？ |
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s******a
发帖数: 472 | 6 EGFP也可以定量吧，如果是过表达我想自发荧光应该不是问题吧。
同意楼上的EGFP-luc，双保险。 |
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W*****o
发帖数: 1780 | 7 表达eGFP融合蛋白，破碎细胞之后，融合蛋白总是有很大一部分是不可溶的。如何提高
表达可溶eGFP蛋白？ |
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p******i
发帖数: 1092 | 9 我把TLR4 cDNA (2.6kb)从macrophage里PCR出来，加上XhoI和BamHI，接到
pEGFP-N1里，测序结果也是正确的，就是TLR4后面接了个in frame fusion的EGFP
但问题是transfect到293T里不亮，而空载体pEGFP-N1很亮……
我现在怀疑是kozak不够强，准备在ATG前面加一个
GCCACCATGGXX，不知道会不会有帮助……
哪位做过类似的实验，请不吝赐教啊，
在下先谢过了…… |
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b******n
发帖数: 4225 | 10 来自clontech的pEGFP-N1的EGFP
用哪的抗体特异性高，效价也高？谢谢 |
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h********n
发帖数: 4079 | 11 用IVIS的机器做imaging, 有什么办法可以增强信号吗?
eGFP是由lentivirus带到老鼠的组织里, 跟luciferase比信号太弱了. 各位有什么办
法吗?
谢谢谢谢. |
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f*****f
发帖数: 195 | 12 单独EGFP，用-20 C Methanol 固定时，发现很多细胞荧光变得极暗或消失（4%PFA正
常），是因为Methanol 消除了GFP的发光信号还是抽提了GFP蛋白？也就是说用GFP抗体
是否还能标记出来？ |
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Z******5
发帖数: 435 | 13 这两种荧光蛋白的检测机器我们动物房都有
要在C57老鼠里过表达一个基因，rtTA诱导的，然后和手头的MMTV-Cre老鼠杂交实现乳
腺组织特异性表达，看老鼠自发乳腺癌是否会增多。
现在想在基因后面加一个IRES-EGFP，或者IRES-Luciferase， 用来指示目的基因的过
表达情况。不知道加哪个好。 |
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j****x
发帖数: 1704 | 14 我们一般用EGFP-Luc fusion protein，效果非常好 |
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r***z
发帖数: 19 | 15 你这个IRES-EGFP是加在最后一个外显子的终止密码子后面还是插入到最后一个外显子
中？ |
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m***y
发帖数: 627 | 16 我在E Coli里表达过挺多的EGFP蛋白，一般都是16-18度0.2mMIPTG低温诱导，在破碎细
胞后加入1%的Triton x-100然后超速离心，GFP融合蛋白都在上清里溶着，看着很漂亮 |
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n*******h
发帖数: 496 | 17 【 以下文字转载自 Neuroscience 讨论区 】
发信人: normandch (norman), 信区: Neuroscience
标 题: 有人知道AAV2.CMV.PI.eGFP 这个里面PI是代表什么吗？
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Feb 25 16:57:28 2015, 美东)
我在网上搜了半天没看到哪里说明，plasmid map里面也没有注明 |
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C********4
发帖数: 308 | 18 一个条件性细胞剔除模式小鼠的诞生 (2013-02-22 18:10:22)转载▼
标签： talen 创业 大鼠基因敲除 基因敲除 杂谈 分类： 个人随笔
对于基因敲除（gene knockout）小鼠大家并不陌生，比如我们想要研究一个基因
在体内的功能，我们就可以把这个基因从小鼠体内敲除掉。而有的时候我们除了关心一
个基因的功能外，还想知道表达这个基因的细胞在体内是干嘛的。比如，我们想知道B
细胞是干什么的，胰岛细胞是干什么的？我们可以从小鼠体内把这些细胞清除掉（也叫
细胞剔除，cell depletion），一看不能产生新抗体了，或是胰岛素没了，血糖升高器
官衰竭了，我们就可以恍然大悟说：“你看，胰岛细胞是产生胰岛素的，B细胞是产生
抗体的”。然后就可以发文章到CNS（Cell, Nature, Science）了。当然这些都被别人
发现过了，是我们没有赶上好时代呀。
那怎样才能在体内把一群细胞清除掉呢？方法可能很多，但也真不多。这里我讲一
个非常简单的方法，就是白喉毒素介导的细胞剔除。白喉毒素（Diphtheria toxin, 简
称DT）大... 阅读全帖 |
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D*****r
发帖数: 1239 | 19 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: longwoodwalk (长木行走), 信区: Biology
标 题: 讲讲我的生物创业过程
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Apr 8 09:21:11 2013, 美东)
我因为最近一直在中国，所以来这里很少了。这次回美国来再到这个版，读帖子觉
得非常亲切，不管是积极的还是消极的，都还是那样熟悉。一时心血来潮就想写点自己
的经历，希望对学生物的朋友有点帮助，或者至少知道还有别的路可以试试。没想到会
有这么多的网友读了，并得到了这么多的祝福与鼓励。非常感谢大家。尤其是好多朋友
还给了非常具体的建议，包括知识产权建议（这些我们已经意识到并跟一个知识产权律
师事务所签订了服务协议）、公司运作方法建议、未来公司应该发展的方向等等。这些
都让我受益匪浅。现在不是我的帖子给大家鼓励了，而是我从大家的回复中获得了很多
的灵感，这对我后面把公司做好非常有益处。
本来在这里是写着玩儿的，以我以前的经验来看，读者应该不过几百人或最多1、2
千人。现在看到这么多人来读，并已经有人把这个帖子转到了国内微博上，我还真有... 阅读全帖 |
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a****y
发帖数: 1035 | 20 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: longwoodwalk (长木行走), 信区: Biology
标 题: 讲讲我的生物创业过程
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Apr 8 09:21:11 2013, 美东)
我因为最近一直在中国，所以来这里很少了。这次回美国来再到这个版，读帖子觉
得非常亲切，不管是积极的还是消极的，都还是那样熟悉。一时心血来潮就想写点自己
的经历，希望对学生物的朋友有点帮助，或者至少知道还有别的路可以试试。没想到会
有这么多的网友读了，并得到了这么多的祝福与鼓励。非常感谢大家。尤其是好多朋友
还给了非常具体的建议，包括知识产权建议（这些我们已经意识到并跟一个知识产权律
师事务所签订了服务协议）、公司运作方法建议、未来公司应该发展的方向等等。这些
都让我受益匪浅。现在不是我的帖子给大家鼓励了，而是我从大家的回复中获得了很多
的灵感，这对我后面把公司做好非常有益处。
本来在这里是写着玩儿的，以我以前的经验来看，读者应该不过几百人或最多1、2
千人。现在看到这么多人来读，并已经有人把这个帖子转到了国内微博上，我还真有... 阅读全帖 |
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J********3
发帖数: 3151 | 21 这个文章有矛盾哈！
文章第5段有如下内容：“且慢，还不行。因为Rosa26启动子太弱了，即使是用EYFP单
基因，阳性跟阴性也只有不到一个log的区别。把DTR-2A-EGFP放那里，谁知道是不是能
够看到EGFP信号呀。所以我们想可以放一个强启动子，于是我们选择了pCAG启动子，这
家伙不但动力强劲，而且是放哪儿都混不吝。也就是文言文里说的ubiquitous。这样就
开始做一个叫做pCAG-loxP-STOP-loxP-DTR-2A-EGFP的工具鼠。”
说的Rosa26启动子太弱了，所以做了pCAG-loxP-STOP-loxP-DTR-2A-EGFP的工具鼠！
可是第6段如下：
“于是我们把它跟一个免疫细胞特异基因（CD19）的cre小鼠交配，年前得到了一只
CD19Cre/Rosa-iDTRGFP小鼠。”
这一句显示并没有用到动力强劲pCAG-loxP-STOP-loxP-DTR-2A-EGFP的工具鼠，明明是
用的启动子太弱的Rosa26-loxP-STOP-loxP-DTR-2A-EGFP工具鼠，呵呵。
自相矛盾啊！ |
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p******b
发帖数: 379 | 22 大家好， 我想做一个双荧光reporter老鼠， 打算构建一个全身表达EGFP和mCherry的
reporter老鼠， 其中mCherry受某个miRNA调控， EGFP不受miRNA调控（作为control）
，因为miRNA结合可能导致mRNA降解， 所以我想把EGFP和mCherry分别表达在不同的
mRNA上面， 请问这样设计可行吗？ pUBC-EGFP-PolyA-pCAG-mCherry-miRNA binding
site-PolyA
谢谢了，请多指教 |
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发帖数: 1 | 23 1 北京大学生命科学学院魏文胜课题组
我们使用了文章中报道的高效ssDNA，同时自己设计了其他2条针对体内其他基因位点的
ssDNA，与NgAgo表达质粒共转HEK293T细胞与HeLa细胞，2天及5天后，用T7E1检测切割
效率，这三条针对2个不同基因的ssDNA，在HEK293T和HeLa两个细胞系中，无论转染一
次还是在8到12小时后再转染一次ssDNA，都没有检测到切割。
针对敲除后能使细胞有表型变化的某特定基因，我们设计了ssDNA，与NgAgo表达质粒共
转HeLa细胞5天后，发现细胞表现出了一定的对应表型，但是把这部分细胞收集起来提
取基因组，对靶位点测序，没有发现基因组序列的任何改变。
我们针对某特定基因设计了6种ssDNA，用特异的荧光报告系统检测是否有靶点DSB产生
，结果显示所有实验组均没有检测到对靶位点DNA序列的切割活性。
2 中科院动物研究所王皓毅课题组
我们在293T细胞中表达带有Flag标签的NgAgo ，在不同时间点检测NgAgo蛋白表达。发
现转染6小时后开始检测到目的蛋白，随着时间的延长蛋白量增加。在人类293T细胞系
中重复原文章中Figure ... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 24 For those who can not access the link
I copied the content here:
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
NgAgo
15 posts by 9 authors
Davide Seruggia
Jun 23
Hi,
I tried a couple of transfections with the NgAgo plasmid from Addgene and
the 5'P oligo against GFP from the paper, but I did not see a dramatic
reduction in GFP+ as seen using Cas9 and a GFP sgRNA.
Anybody tried as well and came to the same (dead) end?
Davide
k*****[email protected]
Jun 24
Hi, Davide,
I tried th... 阅读全帖 |
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g*****n
发帖数: 250 | 25 如果切掉的不是3个，后面的编码就变了，就不是eGFP了。那个stop codon (正文里是
TGA，Supplementary Figure 7里是TAG）不在靶区，这个设计的问题就更大了。要想破
坏它，就只能移位，后面的编码就必定乱。无论如何，用这个方法来破坏stop，又要使
eGFP in frame就是天方夜谭。
你怎么知道“EGFP-linker-mRFP 的FRET效率低于0.1”？这个取决于linker的大小和性
质。作者并没有讨论这个。无论如何，这个形象存在，实验上就不可不考虑。 |
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l**********k
发帖数: 189 | 26 不知道能不能发，如果版主觉得不合适，就删了吧。谢谢。
媒体上关于创业的文章大部分都是有关互联网的。而生物医药相关的创业文章
则很少，可能是因为生物医药类创业很难一夜暴富，没有什么抓眼球的戏剧化题材。生
物医药创业跟互联网创业不同，它有自己的规律，其价值（估值）的增长跟互联网创业
也不可同日而语。生物医药创业是一个非常漫长、需要耐得住寂寞的过程，需要我们静
下心来，认真地做。
自从我于2008年6月在美国Massachusetts州成立的Biocytogen公司，2009年11
月注册成立北京百奥赛图基因生物技术有限公司，转眼7年多了。 有人说公司已经过了
初创期了，但我觉得我们还处在创业期，离成功还很远。总有人问我一些关于创业的感
受，比如压力什么的，我的答案是“比做博士后轻松多了”。我说的是真的，回答也是
认真的，当然也许创业比做博士后更适合我。因为我经常想，如果现在我还在做博士后
，是梦想做教授还是去创业？我现在会毫不犹豫地回答选择创业。在创立百奥赛图之前
，我自己没有在任何公司工作的经历，大家可以想像，创业过程中该遇到的坑，我几乎
都遇到了。在我读《创... 阅读全帖 |
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e****a
发帖数: 17 | 27 Maybe you can try different protocals by using only EGFP, and check the cells
at differnt time points ,you will be able to see the EGFP expression by
noticing the green cells under fluorenscent microscope, so that you are able
to tell the time course of plasmid expression in different protocals.
And different plasmids have differnt expression patterns, I would try to
harvest transfected cells at different time points and measure the protein
level.
usually people harvest transient transfected cel |
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m******5
发帖数: 1383 | 28 我觉得之所以不卖EGFP了是因为没版权了……
EGFP我觉得已经够亮了，ZsGreen用的人不够多有点怕 |
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a****d
发帖数: 1919 | 29 regular EGFP is fine for stable cell line, it's bright enough. Plus all
there are several great antibodies for EGFP, but not for other XFP. |
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p****l
发帖数: 291 | 30 如果你的癌细胞本身有标记，比如EGFP或者特殊表面标记，FACS
如果没有，把你的细胞的受体老鼠换成EGFP老鼠，FACS |
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m**********d
发帖数: 137 | 31 Lgr5-EGFP-IRES-creERT2/APC(flox/flox)
GeneX(flox/flox)
GeneY(flox/flox)
三组老鼠都是C57BL/6J background, available at jackson lab
拿来cross，希望两年之内拿到Lgr5-EGFP-IRES-creERT2/APC(f/f)/GeneX(flf)/GeneY(
f/f)老鼠
版上的老鼠大牛们指点指点，breeding的过程中可能出现啥倒霉情况，能让整个
project彻底泡汤，谢拉 |
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d********0
发帖数: 318 | 32 我看到一篇文献，有几个转基因小鼠出现在文章中，该基因为A
1) A +/GFP
2) A GFP/-
3) A GFP/RA
4) A +/-
请问：
1）上述4个动物分别代表什么意思?
2）A-EGFP BAC转基因的小鼠，请问此类小鼠与一般的A-EGFP转基因小鼠，有何区别？ |
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x********u
发帖数: 430 | 33 I have constructed several gene circuits and got some unpredictable data (
Please open the link for the attached figure)
P: inducible promoter
P': constitutive promoter
X1 and X2: protein binding site (which will affect the expression level of
eGFP when the regulator protein binds them)
R1 and R2: putative regulator protein for sequence X1 and X2, respectively
eGFP: enhanced green fluorescence protein/reporter gene
A broad range of inducer concentration which known to bind effector R1 and
abolis... 阅读全帖 |
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a*******a
发帖数: 4233 | 34 oe的wb都做不出来。。 这表达量也太那啥了吧。
1. 换EGFP抗体。
2. EGFP后面尽量跟一个tag。 |
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l*****g
发帖数: 43 | 35 用EGFP的mRNA转细胞，用RNAiMAX （in vitrogen），同一孔细胞，第一次可以达到100
%的delivery （EGFP信号），重复转移（同样的条件）第二次，三次转移效果就很差，
百思不得其解。请问有转mRNA有什么trick吗
以前也碰到这个问题，某几天90%是绿色的，某两天又很差，一直解决不了这个问题,很
困惑也很耽搁事情 |
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L***s
发帖数: 133 | 36 做了只转基因小鼠，lox-STOP-lox-gene-EGFP，EGFP是fuse在gene的C末端，target的
位置是ROSA26。
体外细胞试验很好, Cre转染后大量的GFP表达，功能也没问题，该基因不toxic。
好了，小鼠做好后，与Nestin-Cre line 杂交后，兴冲冲做了IHC (rabbit GFP Ab, invitrogen) ，结果很失望，发现GFP表达弱，且阳性细胞少；同样的Cre line 和ROSA26-YFP杂交后，同样的染色，YFP表达很强，阳性细胞很多。
帮忙分析一下原因
1. Fusion protein的问题？可能是fusion protein 表达量低？或是表达量可能并不那
么低，但在PFA fix时导致fusion protein被mask了，所以IHC看不到，证据是lox/lox
比lox/+的阳性细胞要多些。试了citrate buffer antigen retrieval (pH6, 95C,
15min)， 结果更差，一点阳性细胞也没有了。其他可行的antigen retrieval 方
法？
2. 因为target的位置... 阅读全帖 |
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y*********u
发帖数: 183 | 37 如图
我要knock in表达的原基因有4个exon，我想插入一个EGFP reporter
，于是把exon1和exon2 replace掉（留下一小部分flanking sequence）
因为这个基因的3'UTR的调控做得很热，因此我就不能引入外源polyA 比如SV40, BGH
polyA等
粗看过去似乎问题不大，我用的EGFP的编码做过修改不含有splicing context
但是也有人说不加外源polyA的knock in表达很靠运气？ |
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g***y
发帖数: 201 | 38 设计一个vector应该尽量实现多重目的。
像你这个设计，我觉得实现的功能比较少。
你这个原则上就是个 complete knockout 的设计
如果你只是想把原基因的前两个exon替换成egfp，那么是想看在transcription level
这个基因的表达。
那么随便从什么地方买个 gene trap就可以了，为什么还要自己费劲做呢？
另外，你这个设计也有潜在的问题，就是如果egfp本身带了stop codon,我 建议你去搜
non-sense mediated decay.
如果efgp没有带stop codon,你想让它作为fusion protein 跟 exon3,4 接在一起，那
我不确定是不是后面的序列会影响
gfp fluorescence,可以随便在什么cell line 里表达看看。
总之，建议你多看看别人的conditonal knockout vector 的设计。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 39 with EGFP marker?
If yes,
Just go to
//www.clontech.com/US/Products/Fluorescent_Proteins_and_Reporters/Fluorescent_Protein_Antibodies/Gre
en_Fluorescent_Proteins
used it PNAS 2012 paper:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22215590
full text link:
//www.cas.zju.edu.cn/dky2008/userfiles/file/13287490419310.pdf
commercial EGFP-specific mouse monoclonal antibody
(Living Colors GFP, Clontech Laboratories)
or
PPT Slide Show:
//www.ars.usda.gov/SP2UserFiles/Program/104/6-09_
RachinskyAPHISprogressreportwebv... 阅读全帖 |
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Z******5
发帖数: 435 | 40 我一开始是想把pIRES2-EGFP上的元件直接替换过去，所以就加了PolyA
不过看了楼上reuse童鞋的意见，我觉得是有道理的，所以真正做的时候就没加。
我已经把两个转录因子都分别克隆进pIRES2-EGFP了，下一步就是要用BsrG1和Nhe1切下
来，连到pll3.7中。
最近太忙了，一直扔在那没做。等我弄好了，确认能表达了，过来给大家报个信。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 41 他们用的不是普通的eGFP, 而是destablized eGFP |
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b******n
发帖数: 4225 | 42 对于荧光蛋白来说，如果要做fusion，最值得考虑的是三点
1）颜色
2）发光形式是多聚还是单体。最好是单体，比如EGFP，AcGFP, mCherry，mStrawberry。
DsRed，ZsGreen等等都是臭名昭著的tetramer，做了fusion之后经常一个皿中没几个发
光的，这种发光的细胞往往对于研究是无效的（这种定位不可靠）
3）relative brightness。如果以EGFP为100，那么GFP(48)，AcGFP(82),mCherry(47)
mStrawberry(78), DsRed(176),DsRed-Express T1(58)，DsRed-Monomer(10),Zsgreen(
117)
相对而言，别的参数大部分都是浮云
如果不做fusion，尽可以选择那些相对发光强度大的比如DsRed,Zsgreen |
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l***y
发帖数: 638 | 43 most likely it is NcoI site CCATGG andw eGFP starts with ATGG.
addgene has a ton of plasmids with IRES-eGFP, i would buy one and take out
the whole fragment to avoid any trouble. |
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m******5
发帖数: 1383 | 44 I don't think they have SAN EGFP
they use mink-EGFP/LacZ which is a whole CCS reporter |
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r***z
发帖数: 19 | 45 这个IRES-EGFP是加在最后一个外显子的终止密码子后面吧，last exon -ires-eGFP-
ployA. |
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m*****z
发帖数: 1451 | 46 需要做EGFP，PE，APC，Pacific blue和PE-Cy7的共染FACS，不过不确定前三种荧光能
否compensate开？不知道EGFP的表达量会不会影响compensation？ |
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r******g
发帖数: 600 | 47 sorry，没有讲明白
2个 独立plasmids,都是retroviral plasmids
promotor是 CMV
最后克隆的两个plasmids
HA-Nter
CMV promoter--Multicloning sites--- HA tag- N-terimus+Transmembrane domain+a
few more C-ter nucleotides----- IRES------EGFP
HA-Cter
CMV promoter--Multicloning sites--- HA tag- Transmembrane domain+C-terminus-
---- IRES------EGFP |
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发帖数: 1 | 48 Sci Rep. 2016 Dec 2;6:38198. doi: 10.1038/srep38198.
Improved bi-allelic modification of a transcriptionally silent locus in
patient-derived iPSC by Cas9 nickase.
Eggenschwiler R1,2, Moslem M1,2, Fráguas MS1,2, Galla M3, Papp O1,2,
Naujock M4, Fonfara I5,6, Gensch I1,2, Wähner A1,2, Beh-Pajooh A1,2,
Mussolino C7,8,9, Tauscher M10, Steinemann D11, Wegner F4, Petri S4,
Schambach A3, Charpentier E5,6, Cathomen T7,8,9, Cantz T1,2,11.
In order to help enforcing bi-allelic targeting with the new ... 阅读全帖 |
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s*******e
发帖数: 23 | 49 (1)
fusiong protein with a enzyme digestion site. overexpress it and digest.
check media by western.
(2)
EGFP fused to N tel. microscopy
(3)
homology search of the N-ter from database.
(4)
I don't know. :) |
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