T**********t
发帖数: 1604 | 1 From wiki:
DMSO is used in PCR to inhibit secondary structures in the DNA template or
the DNA primers. It is added to the PCR mix before reacting, where it
interferes with the self-complementarity of the DNA, minimizing interfering
reactions. |
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e***o
发帖数: 344 | 2 谢谢，回复。不知你pcr的时候有什么技巧。
对了忘了说一声，我的实验要求高保真。所以一些活性超强的酶不敢用。也不敢多加
mg2+, dmso之类的东西。 |
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w********r
发帖数: 1431 | 3 对高GC的PCR，加1M betaine，dCTP/dGTP的量加倍，
然后DMSO 3-7% 和 退火温度一起，做一个二维的梯度试一下条件。
这个条件对付GC rich PCR，用了的都说好。
good luck!
ATG |
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x**x
发帖数: 92 | 4 Mutagenesis help：请问如何插入一段 ~20bp的片段 （large vector+insert）？
Vector: 5kb
Insert: 4kb
total: 9kb
用Stratagene (agilent)的程序设计的引物。
试着用QuikChange XL kit, 不同的polymerase (PFU ultra, PrimeStar supermix, HF
PCR supermix), DMSO浓度。全都不行。
请大家给些建议， 谢谢。 |
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k*****o
发帖数: 1486 | 5 温度。DMSO。另外看不懂：“昨天colony PCR出了带结果质粒酶切后nothing” |
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r******y
发帖数: 21907 | 6 同样的ligation以前做过，没加过DMSO，都是按protocol做的，昨天我做了colony PCR
，就是直接拿colony做template,用我的gene specific primer扩增，有我要的大小的带
，但是提了质粒再酶切没有我做的gene的insert...... |
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w****n
发帖数: 25644 | 7 【 以下文字转载自 Chemistry 讨论区 】
发信人: wyiqin (QQ), 信区: Chemistry
标 题: 色谱中的载荷量和上样量是一个意思吗?
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Dec 15 16:40:42 2010, 美东)
本人不是化学专业的, 我想翻译下面这句话,有谁可以帮忙看看什么意思吗?
400 μL injections of DMSO in SFC result in higher loading and better
resolution for achiral applications as compared to samples injected in the
same volume of methanol.
在这句话里,"higher loading"应该翻译成更高的上样量,还是更高的载荷量?这两个是
一个意思吗? |
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s******y
发帖数: 28562 | 8 50 或者 100 ug/mL， DMSO
不过这些浓度或者什么的不太可能出问题，因为我不是第一次用cycloheximide,
以前用的时候没有出过问题。就是这一批有问题。 |
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l***7
发帖数: 50 | 9 Yes, more than 70% GC. I have tried 10% DMSO or Enhancer Buffer from
Invitrogen for the PCR. |
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l*****a
发帖数: 1431 | 10 10%DMSO 有点高了。你的PCR有positive control 或者说 在genomic DNA 上work吗？ |
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s****l
发帖数: 395 | 11 加DMSO试试，用自己提的taq比较好，至少浓度有保证 |
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f**g
发帖数: 28 | 12 Hi everyone,
I made some stably transfected cell lines with 293 cells. One cell line is
difficult to freeze down. Most cells were dead after frozen with 10% DMSO
in serum. Other cell lines are pretty normal. So anyone can give
suggestion on this problem?
Many thanks in advance. |
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W****C
发帖数: 1937 | 13 你转了啥 让细胞变的对温度敏感了？ 或者对DMSO敏感了（这个应该可以在5-20%调解
）？ |
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W****C
发帖数: 1937 | 14 不冰冻的时候完全生长正常？ 这个gene没有已知功能？
你先试试不同浓度的DMSO看看有没有作用啊。
要是对冰冻敏感的话， 是不是跟膜结构有关的？ |
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s*********s
发帖数: 110 | 16 我送你一个，屡试不爽的~
1.Computer-Aid Primer design
http://www.bioinformatics.org/primerx/cgi-bin/DNA_1.cgi
2.Mutagenesis(20uL) :
5XBuffer: 5uL
dNTP(5mM):0.5uL
oligo(F):0.5uL
oligo(R):0.5
template:100ng
DMSO:1.25uL
Phusion:0.3uL
Add water to 20uL
PCR setup
98 C, 30'
98 C, 10' --
65 C, 30' -- (X 23 cycle)
72 C, 4min --
72 C, 10min
4 C, forever
3.Dpn I digestion( 1uL and at least 3 hours)
4.transformation(5uL) |
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q*****d
发帖数: 445 | 17 最近要做library, 使用这个实验室的方法进行易错PCR
（http://www.msg.ucsf.edu/agard/Protocols/PCR_Random_Mutagenesis.htm），酶
是NEB的Taq,但是效果一直不是很好，35 cycle PCR的浓度还是很低，30cycle特别的少
，请问
大家有什么方法提高产量吗？还是我的方法不够好，谢谢大家。
PCR Random Mutagenesis
Materials
1. Parental plasmid
2. Oligos surrounding region to be mutagenized
3. Error-prone PCR buffer (10x is 100mM Tris-HCl, pH8.3; 500mM KCl,
70mM MgCl2, 0.1% (w/v) gelatin.)
4. 10mM MnCl2 (stock) (make sure there is no brown coloring to
stock soln; if there is it means... 阅读全帖 |
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B******o
发帖数: 496 | 18 没那么夸张。我5年前买的RA，DMSO溶了冻80以后用到现在照样能分化细胞 |
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l******g
发帖数: 1623 | 19 看看局部的GC含量?PCR KIT好不好用?
加DMSO,延长extension时间 |
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i*****g
发帖数: 11893 | 20 加DMSO 可以到10%，
以前PCR过一个cDNA， N端严重hairpin |
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s******s
发帖数: 13035 | 21 是不是有什么二级结构被skip了？看看序列？加点DMSO? |
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s******s
发帖数: 13035 | 22 首先引物设计对么？
模板要多用，要加DMSO,酶要好酶（Hifi Taq一类，最好加taq extender)，pcr
温度要低。当然这都做到了，有些还是批不出来，你最好多设计点引物，至少
有个阳性对照吧？ |
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m*****u
发帖数: 15526 | 23 PCR反应条件的问题。加Mg和DMSO试试。不想费事的，用clontech的Terra PCR mix,连
DNA都不用提，切尾巴尖直接p,我用还没有不出结果的 |
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b********h
发帖数: 348 | 24 刚刚发现昨晚做完实验efluro 670 （类似CFSE）的荧光染料落在hood里没有收，还x-
ray照射了一晚上，会不会有影响啊？
efluro 670说明上指示用DMSO 溶解之后要-20度保存，结果我这个室温x-ray几近24小
时照射会不会已经失效啦？ |
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z*t
发帖数: 863 | 25 目前在用real-time PCR扩一段基因组上GC rich region,设计了几条引物扩增不同的区
域，普通PCR跑胶没有见到可见的smear或者dimer。用ABI的SYBR green master mix
dissociation curve能见到多个peak，amplication curve也很奇怪。跑胶可以看到
smear和dimer...最简单的方法是换引物。。。但是俺要扩的区域CG含量很高。。。换
了primer估计还会有类似问题。。。
对付high CG常用的DMSO/Betaine啥的，在real-time PCR中有没有类似应用？
求做过high gc real-time PCR的大侠指点迷津啊 |
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k****l
发帖数: 279 | 26 You should go ahead and try different primers
GC content is not a problem if you amplify 100bp
No DMSO needed |
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t**********8
发帖数: 223 | 27 我們都是買powder 自己配，溶在DMSO 裡面，效果很好啊 |
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s*********y
发帖数: 292 | 28 见过有人把细胞装在1.5ml的管子里，不加DMSO，然后塞在衬衣上面那个口袋，贴身坐
飞机回国，回到目的地后找个实验室马上养上。如果细胞不是那种很娇气的是能够养活
的。关键是要把管子灌满液体，要不液体晃来晃去会把细胞弄死。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 30 这种东西我们一向都是用DMSO来做stock
要用水也行，加TE buffer 后放在暗处/室温放过夜，然后离心去掉不溶部分。
。。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 31 可能是二级结构的问题。
不妨加点DMSO or betaine 试试 |
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h***e
发帖数: 146 | 32 我也经常做
引物有80甚至100bp的尾巴
高GC可以加DMSO
我们都是用50ul体系 酶有Phusion或者5primer的taq很好pcr的
楼主莫非是要做recombineering？ |
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s******a
发帖数: 472 | 33 是要做recombineering
我用的也是Phusion的
Finnzymes’ Phusion® Hot Start ii High-Fidelity DNA Polymerase
有一次P出来过，条件是：
MgCl2 1.5mM
DMSO 3%
Polymerase 1U/100µl
Template 50ng/100µl
Primers 250nM-250nM
dNTPs 200µM
当时是25µl体系
huiee同学经常做，不知道用的什么条件？ |
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h***e
发帖数: 146 | 34 dddH2O 34ul
5X buffer 10ul
dNTPs 20mM 1ul
primer1 50mM 1ul
primer2 50mM 1ul
DMSO 1.5ul
template 1ul
Phusion 0.5ul |
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M*****n
发帖数: 16729 | 35 这个用DMSO配成多少浓度的stock solution？
要不要aliquote 之后freeze at -20?
反复冻融是不是不好？
在室温下，rapamycin是不是不稳定?
谢谢 |
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v*********d
发帖数: 382 | 36 DMSO 比ethanol 好，50mM stock，aliquote，－20
其实还算比较稳定的 |
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s********s
发帖数: 67 | 37 我用来给老鼠打针，用DMSO配成100mg/ml储存液。我们处理细胞用100nm。 |
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V***b
发帖数: 3419 | 38 20 nM is more than enough to inhibit TORC1. Stock solution 20 uM in DMSO;
make small aliquote and keep in -80; freeze-thaw cycle does not severely
impair its function, but not recommended. |
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C**S
发帖数: 522 | 40 我先用DMSO溶解DSP，再加到无钙镁的PBS里，立刻就形成大量结晶状沉淀。求教问题出
在哪里？ |
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C**S
发帖数: 522 | 41 先用DMSO配成10mM，1:10加到PBS里。 |
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C**S
发帖数: 522 | 42 谢谢，我试试看。还有一个问题，你们用DSP都是买小包装的，一次用光吗？溶在DMSO
里，分装冻在-80可以吗？
Chaps? |
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s**u
发帖数: 2429 | 43 90% FBS + 10% DMSO is ok?
or get some DMEM is free |
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k****o
发帖数: 589 | 45 最近到手这个小肽，按别人的建议用DMEM溶解了，浓度20mg/ml，无悬浊颗粒。之后分
装到小管里－20度冻存。过了两天室温下溶解却发现有紫红色沉淀物，估计是酚红指示
剂但是不清楚小肽是不是也沉淀了。送我样品的实验室用的储存浓度是1mg/ml，他们说
没有遇到过溶解问题。这个肽有疏水和亲水部分，DMSO溶没有问题。请教这种情况可能
是什么原因，谢谢！ |
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c****d
发帖数: 681 | 47 我做过10来个蛋白，最高到过8-10% 没事。in vitro binding的话5%一下一般来说没啥
问题。不过楼上说的对，case by case。你要做control， optimize conditions |
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l**********1
发帖数: 5204 | 49 please go to
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20228280
or
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18977028 |
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I***a
发帖数: 13467 | 50 谢谢，
同样的受体在HL－60cells上的行为，
跟在macrophage 或是DC 上不一样，
但是又没有真的neutrophil 拿来试一下。 |
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