T**********t
发帖数: 1604 | 1 我就是用的BL21(DE3)pLysS strain，用0.4mM的IPTG诱导，表达4hr，蛋白产量很好。
T7 lysozyme是T7 RNA polymerase的natural inhibitor，它的表达是为了抑制在BL21(
DE3)里比较常见的leaky expression，但是这个表达量不至于抑制被IPTG诱导后的
expression。而且lysozyme不是蛋白酶，不可能降解你的蛋白。
你的蛋白如果用BL21(DE3)表达很好，说明你的蛋白对E.coli没有细胞毒性，你可以不
需要用BL21(DE3)pLysS来表达。
还有就是你看一下你用的是BL21系列还是BL21 Gold系列，这两个系列都有(DE3)和(DE3
)pLysS，但是我用BL21 Gold系列就碰到过表达不出来的问题。我说的BL21和BL21 Gold
都是Stratagene（现在的Agilent Genomics）的产品，不知道别的公司是不是也是这么
标识的。 |
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g*****y
发帖数: 6325 | 2 我的蛋白bl21(DE3)的细胞里0.5mM IPTG induction 表达很好。后来转到BL21(DE3
pLysS)里 加IPTG却不表达我试过
0.1-2mM的IPTG. 2hr, 4hr 和 o/n. 2mM IPTG O/N 好像有一点点表达。。 都是同样
的蛋白同样的hosting vector. 现
在怀疑是不是BL21(DE3 pLysS)里表达的lysozyme 把我的蛋白降解了? 不太可能啊！
大家有没有遇到类似的情况呢？ |
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s********n
发帖数: 2939 | 3 既然在BL21(DE3)表达很好的话，为什么还要试BL21(DE3)pLysS呢？有特殊原因？我的
经验是BL21(DE3)pLysS表达很多蛋白都不好。 |
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H*g
发帖数: 2333 | 4 Sorry only could type in English using lab computers
I a trying to express protein in E.coli and am wondering if I should save
glycerol stocks for transformed
BL21(DE3) or Rosetta2(DE3) strains for future or should we always start from
a new transformant?
How often does mutation occur in these strains?
Thanks a lot! |
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T**********t
发帖数: 1604 | 5 对，还有一个我忘了说，就是检查一下培养箱温度。
我原先用BL21-Gold的DE3 pLysS表达出现问题troubleshooting的时候，后来发现就是
培养箱温度不对，设定37度，实际到了39度。这时候用BL21的DE3 pLysS表达就没有问
题，但是BL21-Gold的菌液几乎完全被lyse掉了。所以后来虽然我把培养箱温度重新设
定好了，还是不敢再用BL21-Gold的菌株了。
induction. |
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g*****y
发帖数: 6325 | 6 是的lysozyme 降解多糖的。。 不应该降解我的蛋白。 我表达好的是bl21 gold. 但是
我最后是必须用plysS这个菌株的因
为这个菌株是从别的实验室拿来的还有另一个特别的属性是我需要的。 我现在想在没
有chlor resist 的LB培养这个菌株一
段时间直到它失去plysS这个vector. 不知道可行吗?
BL21(
DE3
Gold |
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n***w
发帖数: 2405 | 7 正在做蛋白表达，用的是rosetta-gami 2 DE3 plyss, 这里各种trouble shooting，我
喜欢～ |
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s********n
发帖数: 2939 | 8 Host strain Genotype
BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL strain E. coli B F– ompT hsdS(rB
– mB–) dcm+ Tetr gal λ(DE3) endA Hte [argU proL Camr] [argU ileY leuW
Strep/Specr]
BL21-CodonPlus-RIL strain3 E. coli B F– ompT hsdS(rB
– mB–) dcm+ Tetr gal endA Hte [argU ileY leuW Camr]
BL21-CodonPlus(DE3)-RIL strain3 E. coli B F– ompT hsdS(rB
– mB–) dcm+ Tetr gal λ(DE3) endA Hte [argU ileY leuW Camr]
BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-X strain3 E. coli B F– ompT hsdS(rB
– mB–) dcm+ Tetr gal λ(DE3) endA metA::Tn5(kanr) Hte [ar... 阅读全帖 |
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f*********p
发帖数: 13 | 9 I do not think you fully understood my answer to your question yet. let me put
it this way.
what kind of BL21 are you using? BL21 has BL21 (DE3), (DE3) pLysS, ...
different subtypes. I assume that you are using DE3 related strains. DE3
strain has a lambda phage lysogenized in BL21 e.coli, on which there is a T7
polymerase gene under the control of lac promoter. when you grow the cells up,
no or very little T7 pol can be expressed. when you add IPTG, it induces the
expression of T7 pol, which the |
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g*****y
发帖数: 6325 | 10 克隆是不能用bl21(de3)的。这个菌株有end3基因表达, 你用来测序的miniprep DNA很
容易被这个酶降解。推荐卖
bl21(DE3)gold. 这个菌株end3已经knock out了。
DE3
（2 |
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j********o
发帖数: 2 | 11 BL21codon+ is indeed BL21 with a plasmid that expresses rare codons and
BL21(DE3)pLysS/E is indeed BL21 with a plasmid that expresses an enzyme that
degrade T7 polymerase to avoid leaky. Both plasmid are chlorepenicol
resistance. In inder to make codon plus in BL21(DE3)pLysS/E strain, drug
marker of one plasmid must be change and the system will become too
complicated - the strain resist to two drug, plus another drug marker for your
recombinant protein.
it.
are
is
no
of |
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r****o
发帖数: 105 | 12 你这个问题我也碰到过。我是表达一个酶的一部分，用的是pET20b,
宿主菌柱是BL21(DE3). 表达出来的蛋白是包涵体，量很大，估计对细菌很
toxic.所以我transform BL21(DE3)的时候在板上硬是只长出了一个colony.
幸运的是可以表达蛋白。
所以你这个问题很正常，mutant之所以比wt更糟糕，也许是因为形成了包涵
体之类的东西。
我提不出什么更好的建议，只能建议你降低一下amp的浓度，说不定会有帮助。
pET系统的origin属于低拷贝，amp的浓度太高可能是菌落无法生长。
第二点比较麻烦一些。建议你先做一个阳性对照，扩增一个常见基因，证明
你的genomic DNA 没有问题。如果这个成功了，试一下touch down PCR好了。
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n***w
发帖数: 2405 | 13 I do glycerol stocks and expressed my protein for couples of times and at
this point, no mutations found. And honestly I do not know the answer... |
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T**********t
发帖数: 1604 | 14 Of course make glycerol stocks for those strains.
It's usually recommended to renew those stocks every 6 months. But I've used
frozen stocks of several years old and still got satisfactory expression. I
guess it may vary from case to case, though.
I would do small scale expression test each time before a large scale
expression culture if I'm worried about the quality of the frozen stock.
Just use a 5-ml culture and induce as how you would with a 1-L or larger
culture (scale down the amount of IP... 阅读全帖 |
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n***w
发帖数: 2405 | 15 Actually many protocols say high concentrations of IPTG can be used at
screening stage, up to 1mM.
used
I |
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T**********t
发帖数: 1604 | 16 I meant the amount of IPTG, not the concentration of IPTG... If you use much
less volume of culture (5ml vs. 1 L), the amount of IPTG needs to be scaled
down accordingly. |
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s********n
发帖数: 2939 | 17 我都是每一次都重新做transformation，平板4度保存，大概可以用2-4周。
大部分Novagen的protein expression strains都是recA+，质粒不稳定，虽然保存在-
80C，接种多次以后难免会有影响。我知道至少有3个negative的例子了。
如果你坚持要这么做，有一个相对low risk的方法，就是用含有葡萄糖的培养基培养，
分装成许多小管，0.5-1 ml （或更大体积），-80C保存，每次拿一管直接培养做表达
，不要多次冻融。
from |
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w**t
发帖数: 52 | 18 接种不用反复冻融吧，我都是n从-80拿出来就用tips挑一点冰渣划在板上。动作快点就
好了 |
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s********n
发帖数: 2939 | 19 到是没有溶解，还是凝固的，但温度还是升高了不少。Anyway，我是由于周围有不少
negative的例子，所以不这么做的，并不是说所有都会出问题。 |
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H*g
发帖数: 2333 | 20 For the negative examples that you mentioned, since the transformed E.coli
could survive antibiotic stress, so
the plasmids are still there. So the researchers discovered mutation(s) in
the coding region of protein
interested in those plasmid(s)? |
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s********n
发帖数: 2939 | 21 我所说的negative不是指质粒丢失了，一个例子是质粒变大了，估计是重组了，蛋白表
达量下降很多；另外两个例子都是蛋白不表达了，估计他们都没有测序，只是重新转化
。 |
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y*****1
发帖数: 73 | 22 哈哈!! 1mM means 1mM final concentration in the culture....
much
scaled |
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T**********t
发帖数: 1604 | 23 我原来在版上发过帖子问过的：
http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31400349.html
你看看和你的culture长得像不像。
实验室表达蛋白用的大肠杆菌菌株都不是野生型的，通过基因改造改良了很多性状。其
中不少是通过噬菌体转染的手段整合到大肠杆菌基因组的。比方说名字含有DE3的菌株
，就是溶源性整合了λ-DE3噬菌体，用于表达T7 RNA polymerase。溶源性噬菌体一般
不会裂解，而是随宿主细胞一起复制。但是极少数情况下会产生自发裂解或者诱发裂解
。我上次碰到的情况是和培养箱温度有关，有可能是培养箱温度过高诱发了噬菌体裂解
，但是其他的一些极端条件也可能会是裂解的诱因。
大部分情况下溶源性噬菌体被诱发裂解是因为宿主细胞遇到了不利的生存条件，我觉得
在你的情况下，会不会有可能是因为minimal培养基营养不够？你试试改改培养基的配
方看？不过我上次在买了新的感受态细胞重新转化之后，对温度也不敏感了，所以也许
换一个新的strain也有用。 |
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A****w
发帖数: 244 | 24 There are a few strains of E.coli(DE3). Which one are you using? I found
Rossetta 2 cells (DE3) is better in my case. As mentioned, low temperature
and low iptg will help expression. Auto-induction is another way to try. Or
leaky expression??
It's hard to say things wrong in expression, even if A and B share >90%
similarity.
Good luck. |
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r******t
发帖数: 629 | 25 用de3是因为实验室有这个cell line，不用买。其实没de3也没关系。
37度有inclusion body，30度压根不表达蛋白。降温表达的目的就是增加可溶性呗。
鉴定方法是sdspage，而且蛋白本身是红色的，瞄一眼就知道是否表达。 |
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k****n
发帖数: 682 | 26 尼玛国内的房子能有一半是买来自主的吗? 普通人1-2套，有点本事de3-4套，贪官人均
几十套，这能没泡沫吗 |
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F**Y
发帖数: 5826 | 27 Dede念de3 de2，就是鸡巴，这个马甲的意思是鸡巴长，灵感源自薛蟠的女儿乐 |
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c*********e
发帖数: 4 | 28 cs master,1年湾区实习经验，快4年DESIGN ENGINEER经验，目前是DE3老板承诺明年给
升MTS。老板突然跳槽，感觉前途不明朗。想去湾区找找机会，不知道我现在的
qualification在湾区的话会给多少的package。
大家可不可以带上公司说大概的package谢过了。 |
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f*******i
发帖数: 295 | 29 是挺累的，但能看懂。
ta1 you3 mei2 you3 shuo1 jian4 li4 duo1 jiu3 de3 ku4 cun2? |
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R*s
发帖数: 2041 | 30 1. never heard of measuring bacterial at OD546 and calculating as u
said below. We only do it at OD600.
2. What temperature you grow the cells? Hope it is 37, not 30.
BL21(DE3)Plyss does grow relatively slower than other E.Coli strains.
However, it is not as slow as yours.
3. In fact, 12 hours for your transformed culture to reach OD 0.8 is not
terribly slow. It usually take us 6-9 hours to do so.
4. Last suggestion, make sure your Amp and Chl concentration is correct.
Even if they are correct, |
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j********o
发帖数: 2 | 31 Yes. Not only BL21codon plus, but almost all BL21s except BL21(DE3)pLysS/E are
leaky. pLysS/E encode enzyme that degrade T7 polymerase to avoid leaky.
In your case with many rare Arg codons, you have to use codon plus. So, it is
importment to avoid leaky? otherwise, just express with leaky if it does no
harm. |
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D****s
发帖数: 5 | 32 要表达一个全长40KD的蛋白，用的是pET32a+ vector. 转化入BL21(DE3) bacteria.
Western 显示full-length protein只有大约10%， 主要被降解成2条非常强的band.
而只表达这个蛋白的fragment（大约一半，20KD), 就没有蛋白降解的发生。
请问有什么好的建议？谢谢 |
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l*********g
发帖数: 41 | 33 我这个蛋白大概60多kd，在pet29a上表达还可以。现在我在大概22-23aa那里突变出了
个bamhi位点，然后呢插进去一个15aa的avi-tag，策序什么的都正确，可是表达和纯化
出了问题。
在BLR（DE3）里面表达，只有一次纯化到了我的蛋白，后来就是重复不出来，至少有四
五次了，我检查诱导前后的带，也没有发现明显的表达带，但是即使在我纯化到了蛋白
那次也没有看到明显表达带。我怀疑质粒丢失，但是在overnight培养后也提到了
plasmid，现在真的找不到什么原因了。 以前大概相似蛋白在同样载体上，随便一表达
，至少可以看到一条表达的带，但是现在什么也没有了。我在想即使蛋白折叠不好，但
是至少肽链在那里，电泳也应该看到的，除非它被彻底讲解了，真是郁闷啊。请高手指
点！！ |
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j*****a
发帖数: 92 | 34 拿有我insert DNA的recombinant plasmid(pRSet A)去测序，１００ ％ 符合。（我的
insert有1.０ kb），transform into BL21(DE3)pLysS Competent Cells 用His柱子纯
化蛋白. SDS-PAGE显示分子量20 kDa, 应该是35 kDa. 谢谢高手们回答。 |
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j*****a
发帖数: 92 | 35 谢谢大家的分析。我的insert DNA是N-His tag。 如果是翻译提前终止或降解，有什么
方法补救吗？
背景：拿有我insert DNA的recombinant plasmid(pRSet A)去测序，１００ ％ 符合。
（我的insert有1.０ kb），transform into BL21(DE3)pLysS Competent Cells 用His
柱子纯化蛋白. SDS-PAGE显示分子量20 kDa, 应该是35 kDa. |
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a***e
发帖数: 1010 | 37 there is always T7 background expression. If that is a concern, try use
BL21(DE3)pLys |
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T**********t
发帖数: 1604 | 38 E.coli的BL21(DE3)pLysS strain。带的质粒是个小质粒，表达的蛋白不大，只有7kD，
没有细胞毒性。用的培养基是LB+M9 salts，抗生素是Amp+Chloramphenicol。关键是以
前摇菌（同一个strain）都没有这个问题，最近屡屡出现，我不知道是哪里
contaminate了，如果是phage的话，就恐慌了，据说很难清除phage。 |
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b********c
发帖数: 161 | 39 invitrogen pEXP5-NT/TOPO vector 和 BL21(DE3)Star competent cell
细胞长到 OD600=0.6~0.8时加入IPTG (final C=0.5mM)诱导表达, 25C和37C都试过,时
间点为2h, 4h 和6h. 然后提纯蛋白和跑SDS-PAGE：诱导前，诱导后，提纯后.
由于T7的leaky expression,我仍然提纯到了我需要的蛋白,关键问题是蛋白的量在IPTG
诱导前和诱导后没有变化。请问到底是哪个环节出错了呢？ |
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H****s
发帖数: 301 | 40 现在在尝试用原核系统（E.coli)表达一个病毒蛋白（400aa)，T7 promoter，BL21(DE3
) host。现在遇到了一个难题，这个基因怎么也克隆不到原核表达载体里去。转化后有
colonies，但是小提质粒后发现没有插入片段。
首先排除的是克隆问题，同样的片段，同样的酶切位点，使用完全同样的试剂，该基因
很容易就克隆到真核表达载体里去。
尝试了cytoplasm表达载体，periplasm表达载体,和不同的宿主菌，都是同样的结果。
（原核表达老手了，头一次遇到这种情况）。
是不是此蛋白毒性太大，即使是一点点的leaky expression都不行？
我现在在想的试验是：（1）做一个这个基因的文库，来看看到底是哪部分有毒性；（2
）使用GroES的leader peptide试试看。
各位有没有什么建议？谢谢。 |
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e****s
发帖数: 1125 | 41 感觉还是不能排除是克隆的问题。
载体不同，Ligation效率会差别很大。
要是没试过的话，可以试试看从那个真核载体里切出来，再克隆到原核载体里去。比
PCR片段直接克隆容易些。
你说的毒性问题，我个人认为可能性很小。可能我做的比较少，还没遇见过这样的情况。
DE3
（2 |
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m**z
发帖数: 787 | 42 用BL21做克隆？不太可行吧？克隆应该还是在DH5a等类似的里面。在这些e.coli里面没
有leaky expression的问题，只有BL21才有这个问题吧
DE3
（2 |
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r**e
发帖数: 20 | 43 我感觉好像也是克隆的问题 , 不觉得leak expression 能这么厉害
原因可能是你的原核载体酶切处理得不好
你当然可以试试DH5a. ^^
DE3
（2 |
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C***N
发帖数: 200 | 44 载体的酶切位点是否是甲基化敏感的？建议在dam-的E coli里提载体，再酶切，连接。
DE3
（2 |
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s********s
发帖数: 67 | 45 如果毒性这么强，克隆的片段应该是一个酶吧？做几个突变试试？ 我以前碰到过毒性
蛋白，但和你的情况不一样，我是诱导之后宿主马上不生长，各种低温条件都试过。
DE3
（2 |
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h**********8
发帖数: 650 | 46 猛男，你先用TOP10搞清楚质粒，再去BL21表达蛋白
DE3
（2 |
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y****l
发帖数: 1 | 47 大家好，我最近拿到了一个十二个跨膜结构膜蛋白的晶体，正在做SeMet标记晶体。
我用的菌株是：B834（DE3）
培养基：M9+19个氨基酸+0.5%glycerol+ 5%glucose +Thiamine+1mM MgSO4+0.1mM
CaCl2+0.05mg/ml selenomethionine+amp
温度：37°
培养时间：24小时
用这样的方法，没4L菌可以大概拿到3毫克的蛋白。
现在问题是3毫克蛋白根本不够我用来长晶体。
问题：
1.在养细胞的时候我发现离心以后上清还是很浑浊，还有大量的菌在上清中无法被离下
来。我
加大了离心的速度和时间，还是无法离下来。有好多菌附着在离心管壁上。不知道这是
为什
么？
2.离下来的菌有一些黄黄的东西，而且是比较多的。通过我的纯化，我发现这些黄黄的
东西是
不能被detergent溶解的，里面没有我的目的蛋白。不知道这些黄黄的东西是什么？
3.离下来的菌在悬在buffer的时候，我发现很粘稠，和我用与表达非标记蛋白用到的菌
的时候
是完全不一样的。是不是菌破裂了，dna跑了出来。很奇怪。
4.长SeMet derivative pro... 阅读全帖 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 48 如果是codon bias
可以
1.用某些特殊的BL21(DE3)菌株，具体不记得哪些选择了，自己去搜一下
2.实在不行可以codon optimize，换成ecoli喜欢的codon
conditions |
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b********c
发帖数: 161 | 49 我老板说他以前也遇到过这种情况,就是完全不表达了,原因不详,所以我们就没有继续
用plys的了. |
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g*****y
发帖数: 6325 | 50 我最后是必须用plysS这个菌株的因
为这个菌株是从别的实验室拿来的还有另一个特别的属性是我需要的 |
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