y****l
发帖数: 1 | 1 大家好，我最近拿到了一个十二个跨膜结构膜蛋白的晶体，正在做SeMet标记晶体。
我用的菌株是：B834（DE3）
培养基：M9+19个氨基酸+0.5%glycerol+ 5%glucose +Thiamine+1mM MgSO4+0.1mM
CaCl2+0.05mg/ml selenomethionine+amp
温度：37°
培养时间：24小时
用这样的方法，没4L菌可以大概拿到3毫克的蛋白。
现在问题是3毫克蛋白根本不够我用来长晶体。
问题：
1.在养细胞的时候我发现离心以后上清还是很浑浊，还有大量的菌在上清中无法被离下
来。我
加大了离心的速度和时间，还是无法离下来。有好多菌附着在离心管壁上。不知道这是
为什
么？
2.离下来的菌有一些黄黄的东西，而且是比较多的。通过我的纯化，我发现这些黄黄的
东西是
不能被detergent溶解的，里面没有我的目的蛋白。不知道这些黄黄的东西是什么？
3.离下来的菌在悬在buffer的时候，我发现很粘稠，和我用与表达非标记蛋白用到的菌
的时候
是完全不一样的。是不是菌破裂了，dna跑了出来。很奇怪。
4.长SeMet derivative protein的晶体时，我发现和非标记的蛋白行为不太一样。在相
同的条
件下，或者附近的条件下，标记蛋白发生轻微的brown沉淀。晶体没有长出来。感觉不
像能长
出来的样子。
5. 在浓缩蛋白的时候，我发现蛋白发生沉淀而堵塞了离心管。不是特别严重，很明显
。我用
的detergent是beta-DDM.
希望有知道的同仁能帮我解释一些这些原因，不胜感谢！ |
J********n
发帖数: 534 | 2 Na+ channel?
Congrats!
【在 y****l 的大作中提到】
: 大家好，我最近拿到了一个十二个跨膜结构膜蛋白的晶体，正在做SeMet标记晶体。
: 我用的菌株是：B834（DE3）
: 培养基：M9+19个氨基酸+0.5%glycerol+ 5%glucose +Thiamine+1mM MgSO4+0.1mM
: CaCl2+0.05mg/ml selenomethionine+amp
: 温度：37°
: 培养时间：24小时
: 用这样的方法，没4L菌可以大概拿到3毫克的蛋白。
: 现在问题是3毫克蛋白根本不够我用来长晶体。
: 问题：
: 1.在养细胞的时候我发现离心以后上清还是很浑浊，还有大量的菌在上清中无法被离下
|
g*****p
发帖数: 451 | 3 3mg的蛋白已经很多了，怎么可能不够你长晶体
又不是做nmr，不需要那么高的浓度的
离心不下来的基本都是细胞死掉了
因为Se-Met的毒性外加你的minimum medium的缘故
另外就是S->Se导致极性变弱了
水溶性太差
达到过饱和的浓度也比原来低了
把你的蛋白浓度稍微继续降低点
【在 y****l 的大作中提到】
: 大家好，我最近拿到了一个十二个跨膜结构膜蛋白的晶体，正在做SeMet标记晶体。
: 我用的菌株是：B834（DE3）
: 培养基：M9+19个氨基酸+0.5%glycerol+ 5%glucose +Thiamine+1mM MgSO4+0.1mM
: CaCl2+0.05mg/ml selenomethionine+amp
: 温度：37°
: 培养时间：24小时
: 用这样的方法，没4L菌可以大概拿到3毫克的蛋白。
: 现在问题是3毫克蛋白根本不够我用来长晶体。
: 问题：
: 1.在养细胞的时候我发现离心以后上清还是很浑浊，还有大量的菌在上清中无法被离下
|
s*******e
发帖数: 1010 | |
s*******e
发帖数: 1010 | 5 Se-Met和WT几乎就是两个蛋白，十几个突变在那里，性质不一样很正常，应该重新
screen生长条件，不能抱住WT的条件不放手。
DDM都出沉淀的话确实不是好兆头，你如果在室温下长晶体的话应该试试4C |
F*******2
发帖数: 103 | 6 3mg的蛋白够你set up不少tray了吧。。。 |
