b********c
发帖数: 161 | 1 invitrogen pEXP5-NT/TOPO vector 和 BL21(DE3)Star competent cell
细胞长到 OD600=0.6~0.8时加入IPTG (final C=0.5mM)诱导表达, 25C和37C都试过,时
间点为2h, 4h 和6h. 然后提纯蛋白和跑SDS-PAGE：诱导前，诱导后，提纯后.
由于T7的leaky expression,我仍然提纯到了我需要的蛋白,关键问题是蛋白的量在IPTG
诱导前和诱导后没有变化。请问到底是哪个环节出错了呢？ |
s********n
发帖数: 2939 | 2 你有没有跑一个whole cell protein的SDS-PAGE？这个可以知道你的蛋白是否大部分在
inclusion body. |
e****s
发帖数: 1125 | 3 我一般在提一个新蛋白以前，先把温度和IPTG条件做个Expression test。
蛋白量上去了，后面就好办了。
IPTG条件多变几个，我手头的蛋白有10umol诱导的，有3-5mM诱导的，条件差别很大。
IPTG
【在 b********c 的大作中提到】
: invitrogen pEXP5-NT/TOPO vector 和 BL21(DE3)Star competent cell
: 细胞长到 OD600=0.6~0.8时加入IPTG (final C=0.5mM)诱导表达, 25C和37C都试过,时
: 间点为2h, 4h 和6h. 然后提纯蛋白和跑SDS-PAGE：诱导前，诱导后，提纯后.
: 由于T7的leaky expression,我仍然提纯到了我需要的蛋白,关键问题是蛋白的量在IPTG
: 诱导前和诱导后没有变化。请问到底是哪个环节出错了呢？
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b********c
发帖数: 161 | 4 不是很了解inclusion body, 在SDS-PAGE上是什么样的?
我提取了诱导前的细胞总蛋白, 但和诱导后的条带基本上是一样的.
K
【在 s********n 的大作中提到】
: 你有没有跑一个whole cell protein的SDS-PAGE？这个可以知道你的蛋白是否大部分在
: inclusion body.
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b********c
发帖数: 161 | 5 多谢了,我会多尝试几个IPTG浓度．
【在 e****s 的大作中提到】
: 我一般在提一个新蛋白以前，先把温度和IPTG条件做个Expression test。
: 蛋白量上去了，后面就好办了。
: IPTG条件多变几个，我手头的蛋白有10umol诱导的，有3-5mM诱导的，条件差别很大。
:
: IPTG
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n***w
发帖数: 2405 | 6 我最近也在做这个，请问你们会跑supernatant和pellet吗？可是pellet像浆糊似的。
。。怎么上样。。。。 |
B****N
发帖数: 18 | 7
要是inclusion body 的话，可溶部分大致相同，不溶部分一条巨带。
【在 b********c 的大作中提到】
: 不是很了解inclusion body, 在SDS-PAGE上是什么样的?
: 我提取了诱导前的细胞总蛋白, 但和诱导后的条带基本上是一样的.
:
: K
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s********n
发帖数: 2939 | 8 从current protocol上改的：
1. check OD600；
2. harvest X ul induced or uninduced culture;
3. add Y ul 1x SDS-PAGE loading buffer (Y=OD600*X/10);
4. Vortex for 30s;
5. 100C for 5 min;
6. 15,000x g for 5 min;
7. Load 5-20 ul supernatant to SDS-PAGE gel.
你也可以向楼上所说，把soluble和insoluble的fractions分离后再SDS-PAGE.
【在 b********c 的大作中提到】
: 不是很了解inclusion body, 在SDS-PAGE上是什么样的?
: 我提取了诱导前的细胞总蛋白, 但和诱导后的条带基本上是一样的.
:
: K
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s********n
发帖数: 2939 | 9 一般来说加了IPTG对蛋白的表达会有明显影响的，如果可溶部分不变的话，很可能都跑
到inclusion body去了。
不过优化蛋白表达是很费劳力的活，如果你的实验对蛋白量要求不大的话，leaky
expression也能凑活着用。 |
b********c
发帖数: 161 | 10 多谢大家了,这样我就不用担心是其他地方的问题了. |
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k*****o
发帖数: 1486 | 11 re确实是的. IPTG浓度条件变化确实很大,另外诱导温度,25度可能还不够低,有的时候
18度也可能产质量更好的蛋白.
【在 e****s 的大作中提到】
: 我一般在提一个新蛋白以前，先把温度和IPTG条件做个Expression test。
: 蛋白量上去了，后面就好办了。
: IPTG条件多变几个，我手头的蛋白有10umol诱导的，有3-5mM诱导的，条件差别很大。
:
: IPTG
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b********c
发帖数: 161 | 12 我按照你的方法做了次SDS-PAGE,但并没有发现任何inclusion body的存在.
我实验室里面也有相同的基因在pGS21a vector里面的细菌,所以我顺便也跑了下这个的
SDS-PAGE,在这个vector 里面 0.5mM IPTG确实提高的蛋白的表达量.
因为TOPOvector出错了，还是由于IPTG的浓度需要做调整？
【在 s********n 的大作中提到】
: 从current protocol上改的：
: 1. check OD600；
: 2. harvest X ul induced or uninduced culture;
: 3. add Y ul 1x SDS-PAGE loading buffer (Y=OD600*X/10);
: 4. Vortex for 30s;
: 5. 100C for 5 min;
: 6. 15,000x g for 5 min;
: 7. Load 5-20 ul supernatant to SDS-PAGE gel.
: 你也可以向楼上所说，把soluble和insoluble的fractions分离后再SDS-PAGE.
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m******5
发帖数: 1383 | 13 应该是：只要有空，18度的蛋白总是最好的
【在 k*****o 的大作中提到】
: re确实是的. IPTG浓度条件变化确实很大,另外诱导温度,25度可能还不够低,有的时候
: 18度也可能产质量更好的蛋白.
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C*******e
发帖数: 4348 | 14 哪个TOPO vector？他们家好几个叫TOPO的
有的是两个方向都有可能insert的
【在 b********c 的大作中提到】
: 我按照你的方法做了次SDS-PAGE,但并没有发现任何inclusion body的存在.
: 我实验室里面也有相同的基因在pGS21a vector里面的细菌,所以我顺便也跑了下这个的
: SDS-PAGE,在这个vector 里面 0.5mM IPTG确实提高的蛋白的表达量.
: 因为TOPOvector出错了，还是由于IPTG的浓度需要做调整？
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s********n
发帖数: 2939 | 15 这就有点奇怪了，你有没有测序验证你的序列是否正确？
BTW: 实验室已经有表达载体（pGS21a）了，你还需要重新克隆么？不能直接用这个载
体么？
【在 b********c 的大作中提到】
: 我按照你的方法做了次SDS-PAGE,但并没有发现任何inclusion body的存在.
: 我实验室里面也有相同的基因在pGS21a vector里面的细菌,所以我顺便也跑了下这个的
: SDS-PAGE,在这个vector 里面 0.5mM IPTG确实提高的蛋白的表达量.
: 因为TOPOvector出错了，还是由于IPTG的浓度需要做调整？
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b********c
发帖数: 161 | 16 我测过序列从T7开始到基因结束没有什么问题.
我老板闲GST-tag太大了,所以想去掉,就重新克隆到TOPO里面了.
难道是因为没有GST-tag,蛋白质就有毒了?
【在 s********n 的大作中提到】
: 这就有点奇怪了，你有没有测序验证你的序列是否正确？
: BTW: 实验室已经有表达载体（pGS21a）了，你还需要重新克隆么？不能直接用这个载
: 体么？
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v**********m
发帖数: 5516 | 17 The GST-tag will artificially increase the solubility of unfolded proteins
fused with a GST-tag, however after the GST-tag is chopped off by a
protease (mostly likely specific ones) the unfolded target proteins will
precipitate out in solution.
GST-tag has nothing to do with the toxicity of a certain protein.
The truth is that most of mammalian proteins or mutant proteins are not 100%
soluble when they are over- expressed in bacteria. What you may do is to
increase the portion of soluble proteins by optimising the expression
conditions, such as host cells, [IPTG], temperature, co-expression with
partner proteins.
You can refer to a handbook written by Novagen about the protein expression
for more information.
http://130.15.90.245/methods/handbooks%20and%20manuals/Novagen%20pET%20system%20manual.pdf
【在 b********c 的大作中提到】
: 我测过序列从T7开始到基因结束没有什么问题.
: 我老板闲GST-tag太大了,所以想去掉,就重新克隆到TOPO里面了.
: 难道是因为没有GST-tag,蛋白质就有毒了?
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s********n
发帖数: 2939 | 18 就像楼上所说，可能是GST增加了你的蛋白的溶解度，而在pEXP5表达载体上表达的可能
是misfolded，然后被host降解了，所以没有看到inclusion body。
还是那句话，如果你需要的蛋白量不大(100-500 ug)，用leaky expression也许就够用
了，或者用GST载体表达，然后用protease切掉GST Tag。如果你需要的量比较大（>1
mg），你可能就需要做一些蛋白表达条件的优化，比如temperature, host, inducer
concentration, chaperones, tags etc.。
【在 b********c 的大作中提到】
: 我测过序列从T7开始到基因结束没有什么问题.
: 我老板闲GST-tag太大了,所以想去掉,就重新克隆到TOPO里面了.
: 难道是因为没有GST-tag,蛋白质就有毒了?
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l*********s
发帖数: 5409 | 19 inclusion body is in precipitates, you need to dissolve it first.
【在 b********c 的大作中提到】
: 不是很了解inclusion body, 在SDS-PAGE上是什么样的?
: 我提取了诱导前的细胞总蛋白, 但和诱导后的条带基本上是一样的.
:
: K
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n***w
发帖数: 2405 | 20 我最近也在做这方面的东西，我发现pellet真是极其难溶，加了不少sample buffer，
最后上样还是粘糊糊的，好不容易上成功了，然后做western，发现pellet里目的蛋白
比supernatant多，但是从gel expression不是很明显。这能说明出现inclusion
bodies吗？我是用的pGEX系统表达的。。
【在 l*********s 的大作中提到】
: inclusion body is in precipitates, you need to dissolve it first.
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