b*****g
发帖数: 119 | 1 新人求教 我在做一个基因的oocyte specific KO 拿到正确genotype的老鼠后 去做
staining 那个蛋白居然还在... 请问会是些什么原因呢 我的mating scheme如下
Cre+ ; fl/+ male x fl/fl female 得到 Cre+ fl/fl female
现在想到的问题有一下几个 1.可能蛋白在Cre前就已经表达了
2. 同时excise 两个有loxP的allele是不是不够efficient阿? 由于我做的是oocyte 所
以尽量选择让公老鼠carry Cre, 因为是homozygous lethal 我不是不是需要一步一步
的去除基因呢
请问大家我该如何着手解决这个问题? 谢谢了! |
D*a
发帖数: 6830 | 2 cre刚切完还有蛋白也是可能的。flox/flox我觉得不影响cre的效率的，cre好用的话一
个两个都无所谓，不好用的话就是不好用了。
你做oocyte 的 genotype了么，是什么结果？直接上staining看蛋白了？当然oocyte
特异PCR不好做，但是你自己想办法看见带吧。
如果cre f/f的母老鼠跟+/- 公老鼠交配，后代应该是一半纯和致死的，你观察到了么？
你现在的信息说这个cre好用不好用都太早。 |
f*******n
发帖数: 141 | 3 有几种可能：
1. cre不行，你没说是哪个cre，帮不了你；
2. 抗体不行，识别的根本不是你的这个蛋白，做过western blot吗？
3. 抗体识别残余的蛋白，那就做RT-PCR验证，看看mRNA的那一段还在不在；
4. genotyping有问题，那就不说啥了。
【在 b*****g 的大作中提到】
: 新人求教 我在做一个基因的oocyte specific KO 拿到正确genotype的老鼠后 去做
: staining 那个蛋白居然还在... 请问会是些什么原因呢 我的mating scheme如下
: Cre+ ; fl/+ male x fl/fl female 得到 Cre+ fl/fl female
: 现在想到的问题有一下几个 1.可能蛋白在Cre前就已经表达了
: 2. 同时excise 两个有loxP的allele是不是不够efficient阿? 由于我做的是oocyte 所
: 以尽量选择让公老鼠carry Cre, 因为是homozygous lethal 我不是不是需要一步一步
: 的去除基因呢
: 请问大家我该如何着手解决这个问题? 谢谢了!
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b*****g
发帖数: 119 | 4 谢谢,
1. 我用的是ZP3-Cre
2. 做western有点不太现实, 蛋白表达度很低, 而且卵子那么小... 需要至少250以上
的卵细胞才能detectable, 需要很多的老鼠, 目前没有那么多.
3.恩 打算下步试试这个RT, 请问从zp3-cre从表达到我做实验应该至少有25+的时间
这个蛋白稳定性很好?
4. 这个应该没有错把... 不然太....耸了...pool了3只老鼠的卵子染色的 每个都有
specific staining pattern 跟control一样...
哎 头疼
【在 f*******n 的大作中提到】
: 有几种可能：
: 1. cre不行，你没说是哪个cre，帮不了你；
: 2. 抗体不行，识别的根本不是你的这个蛋白，做过western blot吗？
: 3. 抗体识别残余的蛋白，那就做RT-PCR验证，看看mRNA的那一段还在不在；
: 4. genotyping有问题，那就不说啥了。
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b*****g
发帖数: 119 | 5 谢谢拉~
oocyte genotype没有做 太费尽了..本来想涂个捷径的
反过来的交配也没有做呢 不好意思 打错了, 不是lethal, 是offspring存活率很差.
么？
【在 D*a 的大作中提到】
: cre刚切完还有蛋白也是可能的。flox/flox我觉得不影响cre的效率的，cre好用的话一
: 个两个都无所谓，不好用的话就是不好用了。
: 你做oocyte 的 genotype了么，是什么结果？直接上staining看蛋白了？当然oocyte
: 特异PCR不好做，但是你自己想办法看见带吧。
: 如果cre f/f的母老鼠跟+/- 公老鼠交配，后代应该是一半纯和致死的，你观察到了么？
: 你现在的信息说这个cre好用不好用都太早。
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D*a
发帖数: 6830 | 6 也就是说P1的应该都有存活了？那么我建议你养四五只母老鼠交配一下看看，是不是后
代出现+/-和-/-的比例大概是一比一，-/-的genotype带是不是纯的，如果表型很独特
的话还可以看看它们是不是显示-/-的表型。虽然四五只母老鼠也不多，但是比例不应
该太离谱，如果你的oocyte理论上能100%敲除的话，有条件多养几只准确性会更高点。
这个不一定比你提卵子麻烦的，而且老鼠也死不了。我倒是好奇怎么提卵子啊，取卵巢
还是superovulation？感觉卵巢里面很难分离卵子啊，而且你的cre在active的里面表
达还是所有卵子都表达啊
我暂时也想不起来更好的检验办法了，对这个cre也不熟
【在 b*****g 的大作中提到】
: 谢谢拉~
: oocyte genotype没有做 太费尽了..本来想涂个捷径的
: 反过来的交配也没有做呢 不好意思 打错了, 不是lethal, 是offspring存活率很差.
:
: 么？
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b*****g
发帖数: 119 | 7 谢谢, 那个fl/+ 和 fl/fl的比例是大致1:1的 现在就是要去研究它在卵子里面的表型
所以也是个未知数
卵子还是很好提取的 先打激素催卵 然后取卵巢 把follicle一弄破里面的卵子就都跑
出来了
按理论上来说Cre 是在所有的卵子里面都表达的 ZP3 是zona pellucida 3 是用来制造
卵子外面一层的糖蛋白 用于sperm egg interaction 但是得等到oocyte 发育到一定的
阶段才表达 但是距里zp3表达到我做实验应该有1个月了 哎 就是不明白为什么还能看
到蛋白
【在 D*a 的大作中提到】
: 也就是说P1的应该都有存活了？那么我建议你养四五只母老鼠交配一下看看，是不是后
: 代出现+/-和-/-的比例大概是一比一，-/-的genotype带是不是纯的，如果表型很独特
: 的话还可以看看它们是不是显示-/-的表型。虽然四五只母老鼠也不多，但是比例不应
: 该太离谱，如果你的oocyte理论上能100%敲除的话，有条件多养几只准确性会更高点。
: 这个不一定比你提卵子麻烦的，而且老鼠也死不了。我倒是好奇怎么提卵子啊，取卵巢
: 还是superovulation？感觉卵巢里面很难分离卵子啊，而且你的cre在active的里面表
: 达还是所有卵子都表达啊
: 我暂时也想不起来更好的检验办法了，对这个cre也不熟
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f*******n
发帖数: 141 | 8 这个cre在growing follicle表达，看别人文章，效率还是不错的。每次实验要分离
oocyte，不能直接用ovary做，是挺麻烦的。可能还是抗体的特异性不好吧，如果是你
这个蛋白能在granulosa cells和oocyte之间转运，那你要发达了。
【在 b*****g 的大作中提到】
: 谢谢,
: 1. 我用的是ZP3-Cre
: 2. 做western有点不太现实, 蛋白表达度很低, 而且卵子那么小... 需要至少250以上
: 的卵细胞才能detectable, 需要很多的老鼠, 目前没有那么多.
: 3.恩 打算下步试试这个RT, 请问从zp3-cre从表达到我做实验应该至少有25+的时间
: 这个蛋白稳定性很好?
: 4. 这个应该没有错把... 不然太....耸了...pool了3只老鼠的卵子染色的 每个都有
: specific staining pattern 跟control一样...
: 哎 头疼
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b*****g
发帖数: 119 | 9 哇 一看就知道遇上行内人了
要是真这样的话我做梦都要笑醒了
我还是乖乖的去看看究竟没有没有在oocyte里recombine吧
【在 f*******n 的大作中提到】
: 这个cre在growing follicle表达，看别人文章，效率还是不错的。每次实验要分离
: oocyte，不能直接用ovary做，是挺麻烦的。可能还是抗体的特异性不好吧，如果是你
: 这个蛋白能在granulosa cells和oocyte之间转运，那你要发达了。
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f*******n
发帖数: 141 | 10 是小同行啊，以后多交流。
【在 b*****g 的大作中提到】
: 哇 一看就知道遇上行内人了
: 要是真这样的话我做梦都要笑醒了
: 我还是乖乖的去看看究竟没有没有在oocyte里recombine吧
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D*a
发帖数: 6830 | 11 fl/+ 和 fl/fl的比例应该是没什么疑问，因为你这一步只是剪尾巴看体细胞。但是现
在你对oocyte敲除有疑问，让被敲除掉的卵子受精看看是不是能长成-/-，我觉得这个
应该比pool卵子更有效一些。
如果你用收获的卵细胞来做PCR或者RT PCR，如果混有别的细胞，会有污染，到时候你
也不知道是因为体细胞污染，还是因为你的卵细胞敲除不完全。
如果这个蛋白敲除不影响卵子受精和胚胎发育，-/-的老鼠我觉得是最有说服力的。
genytype的问题毕竟还是用genotype最有说服力。这是我能想到的方法了，不知道其他
人都是怎么做的。
PS我突然想到卵细胞是单倍体啊，按你写的母鼠genoytpe，你的Cre应该只能进一半的
细胞里啊，所以你的卵细胞不是应该只有一半是KO的？还是Cre相当多没有allele的卵
子里面也会有Cre蛋白？反而你的细胞里都是flox单倍体，没有两个等位基因需要敲除
啊，跟两个flox还是一个flox的效率没关系啊。
【在 b*****g 的大作中提到】
: 谢谢, 那个fl/+ 和 fl/fl的比例是大致1:1的 现在就是要去研究它在卵子里面的表型
: 所以也是个未知数
: 卵子还是很好提取的 先打激素催卵 然后取卵巢 把follicle一弄破里面的卵子就都跑
: 出来了
: 按理论上来说Cre 是在所有的卵子里面都表达的 ZP3 是zona pellucida 3 是用来制造
: 卵子外面一层的糖蛋白 用于sperm egg interaction 但是得等到oocyte 发育到一定的
: 阶段才表达 但是距里zp3表达到我做实验应该有1个月了 哎 就是不明白为什么还能看
: 到蛋白
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D*a
发帖数: 6830 | 12 你说得距离ZP3表达有25天了，是说性成熟25天了吧，因为从打激素到取卵子应该等不
了25天吧，一个星期就得取了吧。
查了一下zona pellucida是在primordial变成primary才出现的吧？也就是楼上
followwen说得growing follicle里面，那么你的大量的静息卵子里面根本没有Cre蛋白
，也就没有KO，所以你如果打完激素就把老鼠切了，那么刚刚激活的卵子里面还有残留
蛋白应该也可以理解
【在 b*****g 的大作中提到】
: 谢谢, 那个fl/+ 和 fl/fl的比例是大致1:1的 现在就是要去研究它在卵子里面的表型
: 所以也是个未知数
: 卵子还是很好提取的 先打激素催卵 然后取卵巢 把follicle一弄破里面的卵子就都跑
: 出来了
: 按理论上来说Cre 是在所有的卵子里面都表达的 ZP3 是zona pellucida 3 是用来制造
: 卵子外面一层的糖蛋白 用于sperm egg interaction 但是得等到oocyte 发育到一定的
: 阶段才表达 但是距里zp3表达到我做实验应该有1个月了 哎 就是不明白为什么还能看
: 到蛋白
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b*****g
发帖数: 119 | 13 谢谢~ 你们都好热心
是这样的, 老鼠在出生后不久绝大多数的primary oocyte就开始生长了, 然后我只是在
25天左右的时候给激素, 2天后提取oocyte. 给激素的目的其实就是更进一步促进
follicle and oocyte growth 等到我提取的时候他们就是已经很成熟的meiotically
competent的卵子了 所以我认为跟我打针后2天就取卵关系不大. zp3 应该出生后不久
就开始表达了 倒是越到后来表达变多倒是很有可能.
那些静息的形态很明显, 这种的卵子和follicle之间还没有形成antrum 所以我是不会
用的.
然后哺乳动物的oogenesis比较奇特 不是contineous process, arrest at prophase I
. 所以在我分离oocyte的时候他们还是在2倍体. 按理说如果cre 有效果的话就已经把2
个都切了
我想法子做个oocyte' genotype或者RT把, 如果不work的话我打算一个allele的敲 做
老鼠genetics 真是费时间阿 T-T
【在 D*a 的大作中提到】
: 你说得距离ZP3表达有25天了，是说性成熟25天了吧，因为从打激素到取卵子应该等不
: 了25天吧，一个星期就得取了吧。
: 查了一下zona pellucida是在primordial变成primary才出现的吧？也就是楼上
: followwen说得growing follicle里面，那么你的大量的静息卵子里面根本没有Cre蛋白
: ，也就没有KO，所以你如果打完激素就把老鼠切了，那么刚刚激活的卵子里面还有残留
: 蛋白应该也可以理解
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D*a
发帖数: 6830 | 14 我课题涉及了一点小鼠生殖，知道个皮毛，肯定不全面。卵子计数从出生到性成熟是迅
速下降的，我理解的是那些出生后马上active的卵子都凋亡了，不会存活25天，所以那
些卵子就算被KO了也已经凋亡了，并不会在你取的里面吧。你取的时候正在active的卵
子仍然还是刚刚才被active的啊，也就是说对这些卵子来说zp3并没有一直活跃25天吧？
I
把2
【在 b*****g 的大作中提到】
: 谢谢~ 你们都好热心
: 是这样的, 老鼠在出生后不久绝大多数的primary oocyte就开始生长了, 然后我只是在
: 25天左右的时候给激素, 2天后提取oocyte. 给激素的目的其实就是更进一步促进
: follicle and oocyte growth 等到我提取的时候他们就是已经很成熟的meiotically
: competent的卵子了 所以我认为跟我打针后2天就取卵关系不大. zp3 应该出生后不久
: 就开始表达了 倒是越到后来表达变多倒是很有可能.
: 那些静息的形态很明显, 这种的卵子和follicle之间还没有形成antrum 所以我是不会
: 用的.
: 然后哺乳动物的oogenesis比较奇特 不是contineous process, arrest at prophase I
: . 所以在我分离oocyte的时候他们还是在2倍体. 按理说如果cre 有效果的话就已经把2
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b*****g
发帖数: 119 | 15 不好意思 这两天没得空
我认为 没有死掉的那些就开始长了 变成secondary- tertiary follicle 等等
然后给了激素后可能就是进一步的促进了antral follicle的形成 我取的就是这种
follicle里面的卵子 不排除有些可能表达zp3 的日子不多 但是至少应该work了感觉
日后多多交流呀~~
吧？
【在 D*a 的大作中提到】
: 我课题涉及了一点小鼠生殖，知道个皮毛，肯定不全面。卵子计数从出生到性成熟是迅
: 速下降的，我理解的是那些出生后马上active的卵子都凋亡了，不会存活25天，所以那
: 些卵子就算被KO了也已经凋亡了，并不会在你取的里面吧。你取的时候正在active的卵
: 子仍然还是刚刚才被active的啊，也就是说对这些卵子来说zp3并没有一直活跃25天吧？
:
: I
: 把2
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a***3
发帖数: 45 | 16 兄弟，你得回去再读读ZP3 那篇文章，要用ZP3 CRE+ FLOX/+ 和WT MALE 杂过才行
【在 b*****g 的大作中提到】
: 谢谢,
: 1. 我用的是ZP3-Cre
: 2. 做western有点不太现实, 蛋白表达度很低, 而且卵子那么小... 需要至少250以上
: 的卵细胞才能detectable, 需要很多的老鼠, 目前没有那么多.
: 3.恩 打算下步试试这个RT, 请问从zp3-cre从表达到我做实验应该至少有25+的时间
: 这个蛋白稳定性很好?
: 4. 这个应该没有错把... 不然太....耸了...pool了3只老鼠的卵子染色的 每个都有
: specific staining pattern 跟control一样...
: 哎 头疼
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l**********1
发帖数: 5204 | 17 Mark!
【在 a***3 的大作中提到】
: 兄弟，你得回去再读读ZP3 那篇文章，要用ZP3 CRE+ FLOX/+ 和WT MALE 杂过才行
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D*a
发帖数: 6830 | 18 那这样的话也可能KO了但是残留蛋白还没除干净，所以只能搞PCR是最有说服力的。。。
我不知道active了的卵子能活多久，好像是迅速就antral了吧，小鼠四五天就一个
cycle啊
【在 b*****g 的大作中提到】
: 不好意思 这两天没得空
: 我认为 没有死掉的那些就开始长了 变成secondary- tertiary follicle 等等
: 然后给了激素后可能就是进一步的促进了antral follicle的形成 我取的就是这种
: follicle里面的卵子 不排除有些可能表达zp3 的日子不多 但是至少应该work了感觉
: 日后多多交流呀~~
:
: 吧？
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b*****g
发帖数: 119 | 19 WT male?? 那个是测试交配吧?
如果正式实验中也那么用, 那岂不是都要有一个 WT allele了? 怎么delete呢? 不懂了
...
【在 a***3 的大作中提到】
: 兄弟，你得回去再读读ZP3 那篇文章，要用ZP3 CRE+ FLOX/+ 和WT MALE 杂过才行
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b*****g
发帖数: 119 | 20 是呢 我觉得这个的可能性很大 要么就是我的抗体问题
4,5天一个cycle 其实只是它的follicle recruitment and growth 最后到ovulation的
过程 所以只是folliculugenesis 的后面一段
primate 也是一样的 真正一个follicle 从dormant primordial follicle 到 pre
ovulatory follicle 需要150天, 也就是5个mensus cycle那么长. 但每次的cycle中只
是recruit 一部分比较成熟的 secondary follicles 进一步成长 所以还是存活时间相
当长的应该cre 算active了比较久的时间了 可能就是蛋白先表达了
况且我给了激素 等于ovarian over stimulation 本来那些要死掉的follicle 全部存
活下来了 跟fertility clinic的促排差不多的道理
。。
【在 D*a 的大作中提到】
: 那这样的话也可能KO了但是残留蛋白还没除干净，所以只能搞PCR是最有说服力的。。。
: 我不知道active了的卵子能活多久，好像是迅速就antral了吧，小鼠四五天就一个
: cycle啊
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f*******o
发帖数: 150 | 21 可以用gdf9cre， zp3primaryfolicle 表达，gdf9在primodiaal 就表达了，早不少，
尤其你的蛋白在卵泡发育早期就有的话，更要用gdf9,说不定有时候还要尝试在PGC中剔
除基因，western blot 完全可以测定，如果用18天小鼠，pmsg后一个老鼠可以娶到100
个gv oocyte, 用14天的你可以娶到200－300个growing oocytyes。 |
b*****g
发帖数: 119 | 22 谢谢, 这就是我们当时决策上的失误,当时没有好好考虑用了别人免费提供的zp3-cre
现在超级后悔....
我从来没有试过那么早做pmsg诶 如果14天就去 pmsg能200-300个oocyte? 太振奋人心
了 对了我的是B6 background 正题感觉比我用的B6X SJL F1要小很多的样子 只要不做
功能性的实验应该不会有影响吧?
100
【在 f*******o 的大作中提到】
: 可以用gdf9cre， zp3primaryfolicle 表达，gdf9在primodiaal 就表达了，早不少，
: 尤其你的蛋白在卵泡发育早期就有的话，更要用gdf9,说不定有时候还要尝试在PGC中剔
: 除基因，western blot 完全可以测定，如果用18天小鼠，pmsg后一个老鼠可以娶到100
: 个gv oocyte, 用14天的你可以娶到200－300个growing oocytyes。
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f*******o
发帖数: 150 | 23 用cre之前要先测定你的蛋白表达谱， 看是否在很早期表达，如果5天左右表达量就很
高，用zp3恐怕就晚了。不过你用不同的cre可以得到不同的结果，这样你研究更全面，
发文章档次也会上去， 所以最好你两个都做，我看到有些人把zp3 cre, gdf9cre 甚至
cumulus cell里的基因都敲掉，然后放到一篇文章里。用b6 没有影响，在文章里表明
所用的种类即可。不同背景老鼠有时候，phenotype有些差别。
一般可以娶到280左右。
【在 b*****g 的大作中提到】
: 谢谢, 这就是我们当时决策上的失误,当时没有好好考虑用了别人免费提供的zp3-cre
: 现在超级后悔....
: 我从来没有试过那么早做pmsg诶 如果14天就去 pmsg能200-300个oocyte? 太振奋人心
: 了 对了我的是B6 background 正题感觉比我用的B6X SJL F1要小很多的样子 只要不做
: 功能性的实验应该不会有影响吧?
:
: 100
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b*****g
发帖数: 119 | 24 我比较惊讶的是在14天follicle就会respond to PMSG嘛? 可不可以丢一个reference
给我呀 当然这些分离出来的oocyte应该不具备meiotic competence 对吧?
【在 f*******o 的大作中提到】
: 用cre之前要先测定你的蛋白表达谱， 看是否在很早期表达，如果5天左右表达量就很
: 高，用zp3恐怕就晚了。不过你用不同的cre可以得到不同的结果，这样你研究更全面，
: 发文章档次也会上去， 所以最好你两个都做，我看到有些人把zp3 cre, gdf9cre 甚至
: cumulus cell里的基因都敲掉，然后放到一篇文章里。用b6 没有影响，在文章里表明
: 所用的种类即可。不同背景老鼠有时候，phenotype有些差别。
: 一般可以娶到280左右。
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f*******o
发帖数: 150 | 25 对不起，我没有说清楚，12－14天你取的是incompetent oocytes, 直径小一些，不能
用pmsg， 要用胶原酶消化卵巢组织，可以娶到280左右。
reference
【在 b*****g 的大作中提到】
: 我比较惊讶的是在14天follicle就会respond to PMSG嘛? 可不可以丢一个reference
: 给我呀 当然这些分离出来的oocyte应该不具备meiotic competence 对吧?
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b*****g
发帖数: 119 | 26 不要紧就是用collegenase 消化对吧 方便的话可以求一个protocol嘛? 非常感谢~!
【在 f*******o 的大作中提到】
: 对不起，我没有说清楚，12－14天你取的是incompetent oocytes, 直径小一些，不能
: 用pmsg， 要用胶原酶消化卵巢组织，可以娶到280左右。
:
: reference
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f*******o
发帖数: 150 | 27 no problem, i will send you protocal next week. have a nice weekend, could
you give me you email address?
【在 b*****g 的大作中提到】
: 不要紧就是用collegenase 消化对吧 方便的话可以求一个protocol嘛? 非常感谢~!
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