H****N
发帖数: 997 | 1 This is very hard to know, since all the copies are the same and it is
impossible to tell which copies are active and which are not. On the other
hand, it is well known that expression levels do not correlate with copy
numbers. Cre toxicity has been reported but the ones I have worked with have
not been too problematic. I think it has to be dealt with on a case by case
basis. |
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a*******g
发帖数: 33 | 2 辛辛苦苦弄了一年，打算在老鼠身上用lysM-Cre敲除一个floxed的基因，结果酶活
性没怎么变化，蛋白含量变化也不到50％，mRNA倒是减少了80－90％。我觉得是很失败
，没法继续干下去了。可是老板一直不接受失败。即便失败，也要我去探讨为什么失败。
博士刚开始，碰到这种事，大家说说该怎么办呢？ |
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S******9
发帖数: 2837 | 3 you need use double LysCre flox.
one cre only delete 40%~60%, double 90~96% |
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Z**********g
发帖数: 222 | 4 -/-是conventional ko, 而fl/fl和fl/-属于conditonal ko;fl/-的优势是减少cre的压
力,效率更高. |
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i*****n
发帖数: 53 | 5 你的CRE没有 表达不够广泛吧。不是在所有lineage细胞里面都表达。因此有些细胞里
切掉了，有些没有切掉吧，最后导致mosaic 表达。 做一下IHC， 或者IF，看一下就知
道了。 |
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g****e
发帖数: 137 | 6 many tissue-specific cre have distinct expression pattern between male and
female. that's why you only can setup one type of mating cage. |
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m*****u
发帖数: 15526 | 7 use cre reporter mice. Such as YFP, LacZ. |
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m*p
发帖数: 226 | 8 If you need a number, you can isolate the Cre-R26Y cells and then do a
realtime PCR. |
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h********n
发帖数: 4079 | 9 我想知道的是epithelial cell里面有多少表达了Cre.
promoter提供specificity, 但不保证每个"这种"细胞都表达, 比如human surfactant
C promoter. |
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D*a
发帖数: 6830 | 10 那还是用 reporter mice 吧，一边是你的细胞有cre的细胞有lacZ或者xxFP，你还可以
做几个epithelial cell特异性的marker，double markers。
surfactant |
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D*a
发帖数: 6830 | 11 或者antibody anti－Cre也可以试试，看见过有人发文章用这种方法做的。
reporter mice的一个问题是时间上会比真正的KO晚一点，因为从KO到蛋白分泌到足够
量的蛋白能够在显微镜下观察还是有段时间的
另外切片比cell sorting方便多了，你还可以看见KO pattern。 |
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j*********a
发帖数: 193 | 13 我试着回答一下好了：
我们公司做了很多这方面的研究，用不同的reporter (GFP, RFP etc)来做Cre老鼠。其
实最好的方法是用luciferase做reporter，用in vivo optical imaging筛选老鼠，非
常灵敏有效。
ＧＦＰ的问题就是波长短，和自发银光近似，抗体不特异，不知道你用的２抗是什么标
记的？如果和自发银光有干扰或者是ＧＦＰ在固定中活性disappear.. |
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s******y
发帖数: 28562 | 14 我们也有类似经历，不过幸运的是我们转进去的只是一个单独的GFP
reporter, 看不到就拉倒了，反正有其他方法来知道哪个是transgenic老鼠.
我们的感觉是很多转进了老鼠内部的基因会有可能被体内的机构关起来不让
表达，或者表达大大降低。
你的情况，最好是这样：
１。把组织提出来做western blot
2. 用anti-GFP 来加强荧光。
我们一向都用Roche mouse anti-GFP，他家的抗体stock solution稀释得比较高，所以
用的时候不能稀释太多(所以比较不经用），但是特异性比较高。
invitrogen) ，结果很失望，发现GFP表达弱，且阳性细胞少；同样的Cre line 和
ROSA26-YFP杂交后，同样的染色，YFP表达很强，阳性细胞很多。
lox |
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f***4
发帖数: 886 | 15 这个很正常的。
检查一下你的TARGET载体构建和ROSA-YFP是不是一样，就是说整合在ROSA的位点是不是
一样。
现在存在的ROSA-YFP要比ROSA-GFP表达强很多倍，解释的原因很多，很多人同意就是整
合的位点不一样。
invitrogen) ，结果很失望，发现GFP表达弱，且阳性细胞少；同样的Cre line 和
ROSA26-YFP杂交后，同样的染色，YFP表达很强，阳性细胞很多。
lox |
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z****u
发帖数: 1007 | 16 我们以前也遇到过同样问题。作为cre reporter的GFP在目标组织里根本看不到。但是
在sorting里能分辨出来，组织里只有上antibody. 分析原因是表达量不足，荧光不够
强，
后来解决办法一个是用H2BGFP作为reporter. 然后最近又找到了一个新的repoeter
mouse line ZsGreen fl/fl 在Jax有。 效果非常理想。荧光很强。 |
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n********k
发帖数: 2818 | 17 my experience is Cre-GFP fusion is horrible...but when use YFP reporter is
great... |
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n********k
发帖数: 2818 | 18 also fusion-GFP sucks most of time...
invitrogen) ，结果很失望，发现GFP表达弱，且阳性细胞少；同样的Cre line 和
ROSA26-YFP杂交后，同样的染色，YFP表达很强，阳性细胞很多。
lox |
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l*********i
发帖数: 332 | 19 how in vitro experiments are done exactly? details.
what kind of cell, what exactly construct have you used?
invitrogen) ，结果很失望，发现GFP表达弱，且阳性细胞少；同样的Cre line 和
ROSA26-YFP杂交后，同样的染色，YFP表达很强，阳性细胞很多。
lox |
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s**********r
发帖数: 13 | 20 I want to konckout a transcription fact in testis,the problem is that Cre is
leaking. |
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l******g
发帖数: 1623 | 21 你说加Cre 酶吗, 这个很难进2层膜跑到核里面去, 还能保持活性吧. 应该作
transduction. |
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s********s
发帖数: 67 | 24 弄个表达cre的质粒transfection 就行 |
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f*******a
发帖数: 671 | 25 哈哈,我也正打算做相似的试验,培养loxp元代细胞再转表达cre的lentivirus |
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D*a
发帖数: 6830 | 26 Rosa
Madisen, L. et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature neuroscience 13, 133-40 (2010). |
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r***e
发帖数: 2539 | 27 cre 免疫荧光很难做，谁有好的antibogy推荐一个？ |
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S******9
发帖数: 2837 | 29 我们的PDGFb Cre是inducible的。 |
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z****u
发帖数: 1007 | 30 做过。不过这个真的是因鼠而异，因line而异。 新生的打药很容易死的，觉得好多其
实就是给针扎死的，所以我都拿滴管来喂。
几周前才做了一个DTA flox driven by Cre-ERT的诱导ablation实验，效果还是很明显
的。每天给4mg剂量的成鼠，一周后都死翘了。因为target的范围太广了。不过我所感
兴趣的组织里面大量的死亡组织能被看到。确实如预期。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 31 De rien.
plus
Bouvier J and Cheng JG.
Recombineering-based procedure for creating Cre/loxP conditional knockouts
in the mouse. (2009)
Curr Protoc Mol Biol. Chapter 23:Unit 23.13.
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19170029 |
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S******9
发帖数: 2837 | 32 这个我也做过，灌胃，每天是3mg，连续5天。这个deletion效果一样。
不能加到水里喂，效果不好。
有那种和食物做到一起的，但是好像很贵，我老板以前舍不得出钱，看见有一个实验室喂含在食物
里面的，每天是1mg，喂42天，我们没买这个食物，结果我给老鼠灌胃了42天，最后还是效果不
好，最后发现是那个Cre的老鼠不work。
base。 |
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l******n
发帖数: 298 | 33 most of the time, cre+/- is OK |
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D*a
发帖数: 6830 | 34 很多cre line大家都不知道插到哪里了，所以想做纯合子有点麻烦，一般自己养都是杂
合养。
另外杂合的交出来一半是littermate的control正好。 |
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m******n
发帖数: 121 | 35
也就是说最后得到的老鼠里面是纯合的flox／flox+杂合的cre+／-？ |
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m******n
发帖数: 121 | 36 这个cre老鼠是别人自己做的有特异promoter的那种。。另外杂合的交一次得到的flox
也是杂合的，还得再自交。。。 |
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O******e
发帖数: 4845 | 37 感染效率很重要。如果只有少部分细胞有Cre表达，WB未必能看到信号。 |
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j****3
发帖数: 48 | 38 看到CPE（>50%)才收细胞的,跑WB的是两个150cm盘的细胞汇总(总共收了20盘细胞，觉
得也不能都用来跑WB)，本以为量应该足够了:-(跑不出Cre蛋白总有点不放心的说。多
谢版主回复 |
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v****e
发帖数: 131 | 39 搭车问一下，哪家公司的ad-cre比较好，我要用它静脉打老鼠！谢谢 |
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s*****i
发帖数: 315 | 40 试试这个
Universal Cre genotyping
Forward primer: ACCAGAGACGGAAATCCATCG
Reverse primer: CCACGACCAAGTGACAGCAATG
94oC 3min
94oC 30s
58oC 30s
72oC 40s
72oC 2min
4oC hold
Positive 400bp band.
genotyping |
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S******9
发帖数: 2837 | 41 Jax lab的tamoxifen inducible Cre老鼠我们都是300和100bp 2个条带，有100的是阳
性的。
这个老鼠我们用了4年了，genotype一直很稳定。 |
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p****o
发帖数: 133 | 42 我也想问一下，我的一直都是cre 100bp的条带很清晰。但有一个问题，postitive的
100bp条带very very very strong,但negative的也有很弱的条带。开始我还以为电泳
加样时不小心污染了，但试了很多次，从PCR从头来过，还是这样。我把那些很弱很弱
的条带都当negative了。希望没有弄错。 |
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a*****s
发帖数: 131 | 43 没有Cre存在，LoxP位点有没有重组的几率？ |
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b*****g
发帖数: 119 | 44 谢谢, 那个fl/+ 和 fl/fl的比例是大致1:1的 现在就是要去研究它在卵子里面的表型
所以也是个未知数
卵子还是很好提取的 先打激素催卵 然后取卵巢 把follicle一弄破里面的卵子就都跑
出来了
按理论上来说Cre 是在所有的卵子里面都表达的 ZP3 是zona pellucida 3 是用来制造
卵子外面一层的糖蛋白 用于sperm egg interaction 但是得等到oocyte 发育到一定的
阶段才表达 但是距里zp3表达到我做实验应该有1个月了 哎 就是不明白为什么还能看
到蛋白 |
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f*******n
发帖数: 141 | 45 这个cre在growing follicle表达，看别人文章，效率还是不错的。每次实验要分离
oocyte，不能直接用ovary做，是挺麻烦的。可能还是抗体的特异性不好吧，如果是你
这个蛋白能在granulosa cells和oocyte之间转运，那你要发达了。 |
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D*a
发帖数: 6830 | 46 你说得距离ZP3表达有25天了，是说性成熟25天了吧，因为从打激素到取卵子应该等不
了25天吧，一个星期就得取了吧。
查了一下zona pellucida是在primordial变成primary才出现的吧？也就是楼上
followwen说得growing follicle里面，那么你的大量的静息卵子里面根本没有Cre蛋白
，也就没有KO，所以你如果打完激素就把老鼠切了，那么刚刚激活的卵子里面还有残留
蛋白应该也可以理解 |
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b*****g
发帖数: 119 | 47 谢谢~ 你们都好热心
是这样的, 老鼠在出生后不久绝大多数的primary oocyte就开始生长了, 然后我只是在
25天左右的时候给激素, 2天后提取oocyte. 给激素的目的其实就是更进一步促进
follicle and oocyte growth 等到我提取的时候他们就是已经很成熟的meiotically
competent的卵子了 所以我认为跟我打针后2天就取卵关系不大. zp3 应该出生后不久
就开始表达了 倒是越到后来表达变多倒是很有可能.
那些静息的形态很明显, 这种的卵子和follicle之间还没有形成antrum 所以我是不会
用的.
然后哺乳动物的oogenesis比较奇特 不是contineous process, arrest at prophase I
. 所以在我分离oocyte的时候他们还是在2倍体. 按理说如果cre 有效果的话就已经把2
个都切了
我想法子做个oocyte' genotype或者RT把, 如果不work的话我打算一个allele的敲 做
老鼠genetics 真是费时间阿 T-T |
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a***3
发帖数: 45 | 48 兄弟，你得回去再读读ZP3 那篇文章，要用ZP3 CRE+ FLOX/+ 和WT MALE 杂过才行 |
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b*****g
发帖数: 119 | 49 是呢 我觉得这个的可能性很大 要么就是我的抗体问题
4,5天一个cycle 其实只是它的follicle recruitment and growth 最后到ovulation的
过程 所以只是folliculugenesis 的后面一段
primate 也是一样的 真正一个follicle 从dormant primordial follicle 到 pre
ovulatory follicle 需要150天, 也就是5个mensus cycle那么长. 但每次的cycle中只
是recruit 一部分比较成熟的 secondary follicles 进一步成长 所以还是存活时间相
当长的应该cre 算active了比较久的时间了 可能就是蛋白先表达了
况且我给了激素 等于ovarian over stimulation 本来那些要死掉的follicle 全部存
活下来了 跟fertility clinic的促排差不多的道理
。。 |
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b*****g
发帖数: 119 | 50 谢谢, 这就是我们当时决策上的失误,当时没有好好考虑用了别人免费提供的zp3-cre
现在超级后悔....
我从来没有试过那么早做pmsg诶 如果14天就去 pmsg能200-300个oocyte? 太振奋人心
了 对了我的是B6 background 正题感觉比我用的B6X SJL F1要小很多的样子 只要不做
功能性的实验应该不会有影响吧?
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