s******r
发帖数: 2876 | 1 谢谢恢复，看到发表的图都是背景漆黑干净，一清二楚，反差明显，
不知道原始照片是不是就这么好，还是有专业的软件辅助处理照片。
不知道用Photoshop锐化图片算不算造假。
glycine主要是加在blocking buffer里。
要做好fixation，infiltration和embedding，剩下的问题才是抗体结合。前面几个步
骤对最后的成像也会有影响。fix的tissue大小如何，fix的充分与否，fix时stress严
重吗？比如你用4%PFA4度fix，小tissue俩小时足够。如果是大tissue，一定要slice之
后再fix。如果sample stress很严重，背景也会很强。如果以上做好的话，那就是抗体
的非特异性结合，用glycine pretreat应该可以减少一些背景。
用软件稍微加强对比应该没问题。confocal的自带软件，imageJ都允许这样。只要你不
是copy&paste，都没问题。 |
|
b******s
发帖数: 1089 | 2 我爱熬夜，来的是不早，但是晚上10点走的那位早上9点前就到。经常confocal从早上8
点book起。但是人家搞了两年也没什么文章。跟大牛比起来，小实验室怎么这么悲惨。
拼命干活，文章拼命也就10几分。大牛实验室，轻松干活，资源丰富，经常不小心就上
cns。。。 |
|
h*****u
发帖数: 201 | 3 最近考虑向系里申请买一件也许用得着的大型仪器，价格要在50万美元上下，我想提议
买个高级的显微镜(比如confocal,PALM,TIRF)或者分析蛋白成分或者序列的质谱仪，想
问问了解行情的朋友这些仪器一般要多少钱？能否推荐几个型号？先谢谢了！ |
|
z****u
发帖数: 1007 | 4 Leica SP5 confocal ~250K
Leica superresolution microscope ~ 500K |
|
H***3
发帖数: 61 | 5 多谢sunnyday给我科普，真的少于50万，自己买的仪器是不是PCR仪，离心机，培养箱
？该不会confocal，EM也要自己买吧。 |
|
s******y
发帖数: 28562 | 6 这个要看具体那个所里面有没有相关仪器，以及是否能让你用。
PCR仪，离心机，培养箱几乎肯定是要自己买的。还有各种玻璃瓶培养瓶之类也要自己
买。
confocal，EM 应该不至于，应该是共享的。
美国那里除了50万之外，是否还包工资？工资是否有保障(如果没有拿到外来的时候）？
如果还包工资，而且系里大部分大型仪器可以共享的话，还是值得去的。英国太小了，
搞藻类的人很少。在美国这里至少还可以借口搞生物能源来骗骗钱。 |
|
l**********1
发帖数: 5204 | 7 Red:
LED module 615 nm for Colibri
Order Number: 423052-9090-000
Green
LED module 505 nm for Colibri
Order Number: 423052-9061-000
Blue
LED module 455 nm for Colibri
Order Number: 423052-9042-000
To view prices and use the basket, you have to be logged in. If you do not
have your personal login information, you can register now.
HTTPS://www.micro-shop.zeiss.com/?s=64035629633c4c&l=en&p=us&f=a&i=
400000000550&o=&h=25&n=1&si=423052-9061-000#423052-9061-000
---
alternatively LZ can DIY
according... 阅读全帖 |
|
n********k
发帖数: 2818 | 8 Thanks...seems I got everything wrong...what I heard was the department
bought him some major instrument including confocal aside from his start-up.
..As for the job market, what I have heard is rather different and it is not
quite proper to elaborate here...Anyway, let me rephrase a bit: for him,
job or not wasn't a concern...
his |
|
n***w
发帖数: 2405 | 9 有一些tissue的confocal images, 每张是3个channel,
想知道如何quantify intensity.
试了一下imageJ里set measurements，用mean gray scale，但是不对。
求指点。
非常感谢！ |
|
D*a
发帖数: 6830 | 10 confocal images出来不都是一张一张的么，3个channels的应该是前期处理过的了吧。
有原始的么，你确定不是叠加了Z之后的。 |
|
w******y
发帖数: 2504 | 11 现在CONFOCAL出来的IMAGE可以只保存叠加的，然后在IMAGE J里面可以SPLIT 然后分析
的。 |
|
x*****g
发帖数: 82 | 12 Position 1 in Nanotechnology for Cancer Molecular Imaging
Description of project: A postdoctoral position is available immediately to
focus on using pH-activatable fluorescent nanoprobes to amplify tumor
contrast with significant background suppression for image-guided resection
of head and neck tumors (HNCA). Prospective candidates will have the
opportunity to work in a highly productive multi-disciplinary environment
with a team of experts in basic and translational research. In particular,
th... 阅读全帖 |
|
k****n
发帖数: 158 | 13 比较常用的有Delta-vision,metamorph, 还有一些confocal 机器也可以的。基本来说
就是选好视野（positions）和 几分钟/秒钟 照相（time intervals ）以及照相多久
，机器会自动记录下照片，然后组成movie。 |
|
v***a
发帖数: 1242 | 14 不是confocal，就是普通的荧光显微镜，看四种荧光（其中包括DAPI），大家有推荐的
荧光染料吗？谢谢！ |
|
l******n
发帖数: 298 | 15 刚看见，，，，
内皮细胞肯定是cd31,这个用confocal做吧，我的是别人做的，肯定是不好做，挑点好
结果就行了，别跟他们较劲。
macrophage经典的还是F4/80,老鼠就是这个，moma-2也不错哦。cd68好像用人多一点，
cd11b就不是很清楚，与分化有关但是不是特异macrophage marker.
Stefanie Dimmeler,做了不少cd31,你看看她有没有相关的cd31.把他的文章引用上，美
国的话做内皮我知道有douglas losordo,他应该也有相关的文章。
祝福好运。 |
|
z*******a
发帖数: 175 | 16 pictures from confocal microscopy on a small sized tissue
have to do quantification using imageJ
got ~2 fold difference between 2 groups
questions:
are intensities of immunostaining are stoichiometric?
variation is so big; seems not believable and not reproducible even by
myself; so is the quantification of immunofluorescence
meaningful at all? especially in tissue instead of cultured cells |
|
s******y
发帖数: 28562 | 17 因为细胞顶起来之后就会比较厚，各个在空间上不同高度分布的光全部都进入
你的显微镜镜头，造成成像模糊。
一般解决方法是confocal microscopy or convolution microscopy
呢？ |
|
b******s
发帖数: 5365 | 18 赞Sunnday!热爱做confocal的本人从此要做你的扇子了，以后还请多多指教！ |
|
o**d
发帖数: 3080 | 19 你做confocal用的isotype control是和做flow用的一样吗？
一般做flow都是先block FcR加封闭（我一般是一起做），再染色，所以我想做cofocal
应该也一样。
你说你的目的蛋白是胞内的，那么做flow的时候一定做了破膜，我对cofocal不是很了
解，但是你是否也应该增加膜的通透性？因为也用可能是你的antibody没有进到细胞内。
希望对你有帮助。 |
|
b******s
发帖数: 5365 | 20 用的抗体和isotype都是和flow一样的.做confocal 时先用4%PFA fix然后用0.1%
triton-X100 permeablize.应该不是通透性的问题,因为我同时染了另一个细胞内蛋白,
那个的染色信号就很好.
请问你用什么做block FcR?你说一起做,是不是指把block FcR的 reagent 和二抗血清
混合一起孵?谢谢!
cofocal
内。 |
|
D*a
发帖数: 6830 | 21 为啥要量这个，找个confocal量你要量的东西不就完了。n幅图像 x z轴距离 |
|
l********k
发帖数: 14844 | 22 我们隔壁实验室作worm的，他们用的显微镜放大倍数低，working distance有好几厘米
，都是直接放petri dish。放大倍数越高，以及对numerical apature要求越高的镜头
，working distance通常越短。而轴向(z)分辨率最重要的一个参数就是NA。所以作z-
sectioning能达到300nm以下解析度的显微镜，比如confocal，objective一般NA都在1.
4以上，而working distance通常不超过0.3mm.
关于折射率不匹配造成的z-distortion，日常生活经验就常见，比如长辈曾经说游泳池
、水塘实际比看着深，不要下去游泳之类。
一般来讲，只要有mismatch就会有distortion，这也是water immersion objective相
比oil immersion的优点之一（盖玻片两边都是水）。这个distortion的修正粗略地讲
就是两边折射率的比值，但是对于大角度的非傍轴光线就不适用了。所以高NA的镜头的
修正不是简单的1.5/1.33（玻璃／水）。或者1/1.33（空气／水） 更详细的解释看... 阅读全帖 |
|
s*****j
发帖数: 6435 | 23 光学成像，也就是会用几个公式而已.
有几个做confocal的知道abbe formula是怎么推出来的? 又有几个能说清楚为什么油
镜分辨率高的道理. |
|
s*****j
发帖数: 6435 | 24 我本来就是感慨一下搞生物的做confocal没几个真正了解成像原理的.
你跳出来说你懂, 我就看看你是不是真懂.
你还觉得你懂? |
|
c*******0
发帖数: 190 | 25 "Resolution" is determined by FWHM of lateral excitation profile which is
usually called "diffraction limit" = 0.61*lambda(ex)/N.A.
For confocal system, this becomes as 0.61*lambda(ex)/N.A*(2^1/2) |
|
l********k
发帖数: 14844 | 26 现在感觉无数实验室蠢蠢欲动想要用storm做点正经东西出来但是都还没超过传统
confocal/tirf的成像质量。几大显微镜商家也赶着推出superresolution kit。不知到
过几年会不会井喷。
话说storm想要出高质量的图，化学条件太苛刻太harsh。再有就是速度。这两点不解决
，大部分的应用就是扯。 |
|
p*l
发帖数: 1359 | 27 我个人认为超分辨要解决的最大问题是活体多色成像，这样才能全方位打倒confocal。
提高分辨率是其次的问题，可是不不知道为什么，大牛们似乎都对分辨率更感兴趣。 |
|
s*****j
发帖数: 6435 | 28 STED还是很有希望. 显微镜未必一定要和生物扯上.
不过这个HELL 是够狠. 上次在加拿大一个 workshop 听他的 video conference 讲
STED. 听众主要是生物方向的. HELL 讲着讲着停下来了, 看看自己的屏幕, 也就是我
们这帮听众, 说, 算了, 讲了你们也听不懂. 我就这样来解释一下吧.
我当时感觉, 靠, 太牛B了吧. 在场听众里还包括james pawley这样的 confocal 权
威.
坐我旁边一加拿大小姑娘愤然道: this guy has an ego.
|
|
a*****a
发帖数: 312 | 29 同意，现在最大的难点是速度；速度上去了，就非常有用了。
现在20nm的分辨率已经比confocal强很多了。 |
|
f******e
发帖数: 125 | 30 搭车问问做FRET， FLIM，CONFOCAL 应用方向的工业界工作怎么找。 |
|
l***y
发帖数: 4671 | 31 人家问得是最大厚度啊。估计是要做 confocal 吧。
我也有这个问题。做小鼠的骨髓切片，我们这里死活也做不到 50um 以上，更别说我希
望的 200um 了。而且骨髓还碎得一塌糊涂，同时骨髓和骨的内壁分离。也不知道是脱
钙脱水时就已经碎了，还是切的时候造成的，还是两者都有。5um 的片子就好得多，但
也有碎的。哪位知道如何可以切得厚？
另外就是厚片子染 DAPI 进不去，外面噪音大，里面没信号。 |
|
l**********1
发帖数: 5204 | 32 Sure.
LZ pls refer one 2012article from Harvad
Optical Coherence Microscopy (OCM) for in vivo imaging of neuronal cell
bodies and cortical myelination up to depths of ~1.3 mm in the rat neocortex
by
Srinivasan VJ et al. (2012)
Optical coherence microscopy for deep tissue imaging of the cerebral cortex
with intrinsic contrast.
Opt Express. 20: 2220-39.
its PubMed link:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22330462
>
----------------------------
人家问得是最大厚度啊。估计是要做 confocal 吧。
我也有这个问题。做小鼠的骨髓切片，我们这里死活也做... 阅读全帖 |
|
t******k
发帖数: 599 | 33 用tile scan扫40x的图像，为啥出来的每个tile之间总是有很明显的断裂，于是拼接出
来的图片都很丑，有人知道这是什么原因吗？ |
|
c********r
发帖数: 189 | 34 tilescan 是这样的，可以设置overlap，一般用5%，但是我觉得0%最好，你可以试试 |
|
Z****9
发帖数: 738 | 35 你的pixel size 矫正了没？
如果矫正了，用10% overlap，不会出现明显的断裂，但是边缘会比中间稍微暗一点 |
|
w********y
发帖数: 288 | 36 我们显微镜也这样，据我经验不是软件问题，最有可能是你的镜头太大，碰到边上
stage了。比如你扫的中心区已经在slide或chamber边缘了，当整个stage继续朝四周移
动的时候，镜头会碰到stage。解决方法就是确保你扫的区域一定在最中心。 |
|
s******y
发帖数: 28562 | 37 听起来是很奇怪。你能不能用免疫荧光来定位一下这两个蛋白在细胞内的位置？
最好用confocal.
的， |
|
u**********d
发帖数: 573 | 38 这难道就是传说中的nuclear matrix？以前用电镜看到的nuclear matrix有人认为是抽
提核内可溶物过程中产生的人工的结果。
最好做个confocal的3d构建，看看充满整个黑内空间呢还是主要在核周。
不过你这个仍然不是生理状态，赶紧做个GFP融合蛋白看看吧。
说不定很快就可以看到chromatin纤维被拉着在轨道上飞奔了？ |
|
g*****n
发帖数: 250 | 39 I speculated, yesterday, how they picked NTCP as a candidate receptor for
HBV. There is nothing wrong to select a candidate based on knowledge. The
key is to determine whether that is the one you are looking for with
evidence. Let’s see how they tested whether NTCP is the receptor for HBV.
(1) They transfected NTCP into cells, cross-linked the viral proteins,
and ran Western. Again, overexpression, forced linking, all are too
artificial. They should look at the native NTCP protein, but they ... 阅读全帖 |
|
y****y
发帖数: 123 | 40 光做IHC不行吧
至少要用EGFP标好tumor然后confocal才可以吧 |
|
g***s
发帖数: 733 | 41 做multi-color荧光，
如果是wide field，是要转filter set一个一个成像吗？能多个filter和camera同时成
像么？
如果是confocal，是不是都是用多个filter和PMT同时成像的？
理论上知道一些，但是不清楚实际应用里是怎么做的。谢谢。 |
|
y**u
发帖数: 7459 | 42 confocal的话，multi-photon和spectrum／white laser都可以同时成像
不能同时成像的一个原因是laser的变换吧，signal是可以同时由几个channel来
collect的 |
|
a*q
发帖数: 2109 | 43 Dichroic Mirror和bandpass filter是干不同的事情的。Dichroic Mirror是用来把激
发光和荧光分开的，但是Dichroic Mirror不能完全挡住从样品反射和散射回来的激发
光（大概能挡住99％，剩下的1％足以完全超出荧光信号了），所以必需再加Bandpass
Filter（好的只能透过10^-7的激发光）。
基本上绝大多数商用机器都可以做这四种颜色，要看买的时候装了哪些激发激光（或者
用汞灯），买了哪些滤色片了。具体实现的方法有很多，一个经典的方案叫做Sedat
Filter Set（根据UCSF John Sedat的要求设计的）。这个方案用了一个四通道
Dichroic Mirror（反射上面说的每四个激发波长而且透射所有四个荧光波长），然后
有四组激发滤色片和荧光带通滤色片，可以依次对四个波长顺序成像。
http://www.chroma.com/product/complete-filter-sets/widefield-mi
在Confocal上，四个PMT同时检测是没有什么问题的，这样要是用上面的四通道
Dichroic Mirro... 阅读全帖 |
|
j****x
发帖数: 1704 | 44 我感觉还是上confocal看定位靠谱一点，否则确实很难说清楚。当然最好还是能搞定合
用的抗体 |
|
n**********7
发帖数: 29 | 45 非常感谢！也在考虑confocal～phd读了两年，做的大部分实验都是用flow，感觉
tricky的地方太多，快被烦死了。。。 |
|
d****h
发帖数: 4291 | 46 你这脑子就属于不行的
难怪要打光棍
你要泡生物妞，起码提DNA，跑蛋白胶，做blot，杀耗子，种苗，起码样样都的学，猫
地下室看5小时confocal不带吐的，看半天电镜也不带翻白眼的。
而且先最好了解一下他们实验室的组会研究进展报告
不下仨礼拜，绝对拿下
看她忙啥，你撸袖子上，然后她在一旁吃爆米花，看肥皂剧
你把data做成发表或者汇报用的图表就成了
当初一哥们，听说一妞的色谱进样管子堵了，人家二话没说，用嘴就给吹通了，当场就
把妞感动的哗哗的。拿下必须的 |
|
l**********1
发帖数: 5204 | 47 RE LZ
可以考虑做虫子的话 加州Irvine New CINQUIN O. Lab
you can try to contact PI:
HTTP ://www.faculty.uci.edu/profile.cfm?faculty_id=5603
Prospective postdocs
The lab will be progressively developing projects in the following areas (
email me for more specifics).
Experimental biology:
imaging of gene expression in live and fixed C. elegans germ lines (with
classical confocal microscopy and FCS), experimental manipulation of the C.
elegans germ line
synthesis of model differentiation switches
more pls ref... 阅读全帖 |
|
k***g
发帖数: 4904 | 48 这玩意是gel stain，倒是真便宜。不过能染完整细菌用吗？我们是在confocal LIF显
微镜下数细胞个数的。 |
|
e***o
发帖数: 344 | 49 不好意思，我没有表达得清楚。我的主要目的是表达这几个蛋白。让他们分的比较开，
彼此没有overlap（就像DNA FISH 那样，不同的颜色分得很开，各自独立）。不然就混
到一起了，只有一个颜色了。
我想过吧他们弄到细胞膜上，或囊泡上，什么的。不知道能不能通过confocal分开。
但是这几个construct要不不带信号肽，要不都得带一样的。因为我还得做得做别的实
验。 不知道我表达清楚了没有。
感谢！ |
|
|
