n******w
发帖数: 70 | 1 ALEXA 488, 555, 645
CY2, 3, 5
colors? |
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z****u
发帖数: 1007 | 2 4个颜色。
GFP, DAPI, Alex 568, Alex 647 as yellow.
many
with |
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c**n
发帖数: 73 | 4 Alex fluor
Dylight
Qdot
many
with |
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q*****n
发帖数: 331 | 5 I used it before, and I think it is easy to use. the image quality is good
too. But I have not compared it with another confocal microscope. |
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x*****o
发帖数: 441 | 6 严格来说,single molecule分很多大方向.Chu,ha还有小薇主要是single molecule
FRET, tweezer做得不多 ,不涉及拉扯.主要研究平衡或非平衡态下得分子自发形变.
Bustamante,block主要是optical或者megnet tweezer,荧光涉及比较少,主要是生物分
子受力下的机理.
这两拨人做得东西相差甚远,但都涉及生物过程的动力学. 但是分析数据的方法不太相
同.
其他的single molecule方向还有sunny xie的活细胞confocal,小薇他们在做的super
resolution等等等等
要是想跳最好找个好老板,这行比较看血统,都是嫡系把持的.好老板还是有很多能做的
好方向.还有就是想清楚是想做哪种single molecule,分类太多了. |
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s*****j
发帖数: 6435 | 7 "sunny xie的活细胞confocal", 这个是什么东西?
"小薇他们在做的super resolution", super resolution 也算成是single molecule? |
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x*****o
发帖数: 441 | 8 就是用confocal显微镜看单个细胞里面的荧光,主要是FRET
molecule? |
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y******8
发帖数: 1764 | 9 Illumina的最大优势是全自动的流程，MiSeq 所需的hands on时间远小于Ion PGM。另
外数据的质量也高很多。HiSeq 2500如果把cBot整合了，配上一个高速的confocal，还
是有可能再撑3年的。
Ion的pH法是把双刃剑，试剂成本应该远低于光学法，但是信号的稳定性差了两个数量
级。Ion要取胜，价格低是王道。
samples
316 |
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b******s
发帖数: 1089 | 10 如果你使用的是一般的laser scanning confocal的话，根据laser source的不同，有
几种固定波长的laser，可以选择。即使不是正好在所谓的maximum上，前后一定范围内
的也是很好用的。488nm既可以激发GFP，也可以很好的激发YFP。你可以设置搜集的
emission的波长，尤其是有两种颜色的荧光的时候。
mRFP和mCherry等都是从最早的DsRed改造过来的。m代表他们大多是单体（我印象里是
这样的），因为dsRed很容易形成四聚体。但是经过改造之后，excitation和emission
都有所变化。但是基本上580nm/610nm都可以很好用。mCherry荧光强度最高，但是mRFP
也很不错。
怎么查？google就可以了。虽然mRFP有很多突变体，Q66M或者是你的Q66T等，主要是促
进了蛋白折叠成熟，用580nm/610nm应该没问题。 |
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H******d
发帖数: 13 | 11 在野生型蛋白的C末端融合GFP后，转入到knockout株系，knockout的表型完全恢复，融
合后的mRNA是正确的，也能用 GFP 抗体检测到期望大小的融合蛋白。本来以为能过一
个快乐的新年了。可是在confocal下根本就看不到荧光，郁闷死了。在线等大哥哥大姐
姐帮帮俺，有哪些可能的原因造成这种现象呢? 谢谢啦！也祝你们新年吉祥如意！ |
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H******d
发帖数: 13 | 12 谢谢您的指点。俺觉得很可能是融合后，我的蛋白功能没有受到影响，但融合导致GFP
本身出了问题，尤其是我这种直接在生理条件下测试。实在没有办法的用CONFOCAL观察
的话，俺得用GFP抗体来搞传统的生化定位了。
..
protein |
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l**********1
发帖数: 5204 | 13 he/she can try stimulated-emission depletion (STED)
paper:
htp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16896340
>We report attainment of subdiffraction resolution using stimulated emission depletion (STED) microscopy
with GFP-labeled samples. The approximately 70 nm lateral resolution attained in this study is
demonstrated by imaging GFP-labeled viruses and the endoplasmic reticulum (ER) of a mammalian cell
Brand:
Super-Resolution Microscope Leica TCS STED
htp://www.leica-microsystems.com/products/confoca... 阅读全帖 |
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p*l
发帖数: 1359 | 14 好的confocal也要80万，还是会有很多地方买得起的。 |
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n***w
发帖数: 2405 | 15 有一些confocal的图片，trace了几个quandrants，想拼起来，弄得好看一些？
请教怎么弄？
谢谢！ |
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p******d
发帖数: 3737 | 16 希望能切出来，这样我做confocal就有望了，呜呜呜。问了一个做脂肪的实验室，居然
说是脂肪太难做冰冻，所以整个实验室都放弃做这个了。据说还是专门做脂肪很牛滴实
验室，晕死。 |
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p******d
发帖数: 3737 | 17 今天我把原来冻的block切了一下，-30度马马虎虎可以切出40micrometer的片子，组织
边缘还是有一些碎掉的迹象，手够快可以在碎的更厉害前贴到片上。乳腺导管结构当然
比较厚，估计做confocal是可以了。但是贴片时候慌慌张张的，老是有气泡。不过已经
很大的进步了，看到了点点希望。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 18 Please go to
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2518226/
>Overall, our results suggest that PUB22 and PUB23 coordinately control a
drought signaling pathway by ubiquitinating cytosolic RPN12a in Arabidopsis.
Subcellular Localization
The sGFP cDNA clone was fused in-frame to the 59 end of the full-length
PUB22 and PUB23 coding region and ligated into the pBI221 transient
expression vector. The sGFP-PUB22 and sGFP-PUB23 fusion constructs
were transformed into protoplasts prepared from wild-typ... 阅读全帖 |
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H***3
发帖数: 61 | 19 我的情况跟前一段时间讨论的一个情况不同。
转基因植物携带overexpression promoter+gene+c terminal GFP，转到野生型里建立
过量表达突变体。基因是核编码的叶绿体蛋白，蛋白N末端一个小酞段引导蛋白
targeting到叶绿体内行使功能。根据抗性筛选到homozygotes,confocal下检测到GFP信
号在叶绿体里，非常阳性。DNA genotyping和RT-PCR检测到基因插入正常，mRNA正常，
现在的问题是western用anti－GFP抗体无法检测到全长蛋白，只有GFP大概27kD左右的
信号。因为是未知蛋白，没有特异性抗体，突变体性状也没有发表过，所以无法确定是
否融合蛋白正确表达。我唯一能想到的是蛋白合成后，送到叶绿体内被降解了。可是即
使有降解，不会全都降解吧。
请大家给点意见，好不容易建立的突变体，实在不想放弃。 |
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f******e
发帖数: 125 | 20 共聚焦的灵敏度应该不会比WIDEFIELD 差很多, 具体没比较过, 也很难比, 因为光源,
光路,成像系统都不一样.CONFOCAL 对ALIGNMENT的要求很高, ALIGNMENT 包括激光,
PINHOLE,DICRHOIC MIRROR.
如果你的ALIGNMENT没问题的话, 你可以把PINHOLE打大, 可以提高信号强度. 还可以
AVERAGE 多FRAME 可以提高S/N. |
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f******e
发帖数: 125 | 21 CONFOCAL 用的是平行的激光, 光可以被集中到很小一个点,
WIDEFIELD用的是发散的光源, 光斑很大. |
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p*l
发帖数: 1359 | 22 If you do confocal a lot, I suggest you keep a stained slide as your control
standard. You can test the control slide first every time under the same
setting. In this way if there is some thing wrong with the scope, you will
know. If there is something wrong with your sample, you will know too.
Invitrogen sells multi-color control slides. They last a long time.
http://tinyurl.com/6t8ue29 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 23 thank you so much
//www.spx.arizona.edu/BME630/Lecture%20Public/Confocal%20Microscopy/Webb%
20confocal%20microscopy%20how%20it%20works.pdf |
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l**********1
发帖数: 5204 | 24 没Veteran 您的指点 书名都不知道 免费可以下载的 PDF
now i got it
Thanks a million.
//www.spx.arizona.edu/BME630/Lecture%20Public/Confocal%20Microscopy/Webb%
20confocal%20microscopy%20how%20it%20works.pdf |
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p*l
发帖数: 1359 | 25 我想厚脸皮提醒这位爱学习的同学一句，看你最近的帖子，觉得很多成像技术你也只是
听说而已。这样狂贴各种各样的信息给楼主，未必能帮忙，反而可能把楼主搞晕了。这
个版上confocal高手不少，大家都不太发言主要是因为问题的可能性太多了，瞎出主意
可能反而帮倒忙。楼主想解决问题，就近找个有经验的人更事半功倍。 |
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V*********r
发帖数: 13 | 26 对了，我以前经常用confocal laser scanning microscopy的，估计安全性上和这个也
差不多？ |
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v*****s
发帖数: 20290 | 27 按我同学的说法，如果SEM是10，TEM就是100。
另外，confocal的maintenance不难，但Build-up就很难了，最近就在搞这个，头大得
很，浪费了很多时间。 |
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p*l
发帖数: 1359 | 28 从理论上来说， section的效果Apotome>Vivetome>Decovolution。Apotome至少需要三
幅曝光，Vivetome只需要两幅。
除了看多层细胞的某层以外，Apotome应该也能看见一个细胞内的不同层。我们山寨的
那个，就是一个朋友想看 membrane vs cytoplasm，但是又不想上confocal。我们做的
时候，就聚焦到细胞中间层。Apotome的grid定位不准的时候，会出条纹。如果仪器的
光路经常漂移，自己又不会调的话，会比较头疼。 |
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b******n
发帖数: 4225 | 29 俺的一个细菌，很小，大概直径0.5um，长5-10um
想通过做一个poteinX-EGFP的融合construct定位(可能是在periplasmic space)
什么样的confocal可以有这种sensitivity和resolution
哪个facility可以提供这种服务呢
谢谢啦 |
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D*a
发帖数: 6830 | 30 小鼠40太厚了吧？好几层细胞都重叠在一起了啊。我们实验室一女生切30就去照
confocal了，否则看不出来到底哪个细胞染上了啊。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 31 庄只是徐福炼丹 给秦始皇炼那个长生不老丹吧?
Xiaoliang Sunney Xie
Raman Scattering is King Route to 单分子Raman scattering 光 (possible)
1)
Single DNA molecule detection in an optical trap using surface-enhanced Raman scattering
//apl.aip.org/resource/1/applab/v96/i21/p213701_s1
Abstract:
Raman spectra from single DNA molecules in their natural aqueous environment are presented. A DNA molecule that is anchored between two optically trapped dielectric beads is suspended in a solution with nanosized silver colloid particl... 阅读全帖 |
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a*q
发帖数: 2109 | 32 FCS不是严格意义上的单分子技术，简单说，就是把观测体积降到特别小（比如用
confocal）。这样的话在可观测体积内的分子个数也会特别少。因为分子在不断扩散进
进出出，所以检测到的荧光信号随体积内分子个数的变化有涨落，分子个数越少，涨落
相对越大。这样从涨落的幅度可以得到平均分子个数，平均荧光信号强度除以这个分子
个数就得到每一个分子的平均亮度；从涨落的时间尺度可以得到分子扩散经过这个体积
的时间，也就可以得到扩散系数。跟FRAP比，FCS完全是在平衡态做实验的。 |
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a*q
发帖数: 2109 | 33 FCS不是严格意义上的单分子技术，简单说，就是把观测体积降到特别小（比如用
confocal）。这样的话在可观测体积内的分子个数也会特别少。因为分子在不断扩散进
进出出，所以检测到的荧光信号随体积内分子个数的变化有涨落，分子个数越少，涨落
相对越大。这样从涨落的幅度可以得到平均分子个数，平均荧光信号强度除以这个分子
个数就得到每一个分子的平均亮度；从涨落的时间尺度可以得到分子扩散经过这个体积
的时间，也就可以得到扩散系数。跟FRAP比，FCS完全是在平衡态做实验的。 |
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c**k
发帖数: 1228 | 34 yes, like mass spec, confocal etc. But i doubt whether the machine is
working properly, or just a Furnishing |
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s******a
发帖数: 472 | 35 fixative应该主要和你要研究的蛋白有关，不同的蛋白IHC染色可能需要不同的
protocol。
Paraformaldehyde |
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v***a
发帖数: 1242 | 39 不知道tissue的话要不要做perfusion？ |
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Z****9
发帖数: 738 | 40 和普通的microscope的最大区别是confocol可以做optical section 通俗点就是可以做
３d重建。比如，有两个荧光团，分别在不同的z position上，普通FL可能区分不出来。
confocol的第二个优点是能利用光学系统的最大分辨率
confocol的bleaching要比普通的microscope快，我知道不同的处理方式会影响
bleaching的速度。如果你按以前的protocol准备标本，bleaching不是问题的话，不一
定需要fellow别人的。 |
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Z****9
发帖数: 738 | 41 大部分公司（zeiss， Nikon）的objectives对cover slip的厚度是有矫正的，都是用
No. 1.5的cover slip（厚度 0.17 mm）做标准
如果希望成像质量最好，用No. 1.5的cover slip
如果不计较成像质量，1号或者2号都可以 |
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n********k
发帖数: 2818 | 42 zeiss， Nikon leica: do they have the adjustable objective to accomendate
different cover slip? I know Nikon has this feature for regular IF... |
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s*****j
发帖数: 6435 | 44 一般也就水镜有矫正, refractive index 不 match. 对cover slip thickness 比较
敏感.
油镜很少有矫正的. |
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p********r
发帖数: 1100 | 46 FIJI IT'S FREE
ZEISS SAVE FILES AS TIFF 16BIT. 8BIT TIFF WILL NOT WORK.
OPEN FIJI, DO IMAGES TO STACK, THEN USING 3D TOOL TO MAKE MOVIES. |
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a*******y
发帖数: 221 | 47 是一个针对transparent一个针对opaque的specimen么
谢谢 |
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m*****l
发帖数: 28 | 49 Shanghai Hengrui Pharmaceuticals Co., Ltd http://www.shhrp.com (China) is now seeking highly motivated professionals to fill the following positions.
Group leader(s), Principle Scientists in stem cell clinical product R&D
Responsibility:
The main responsibility is to develop stem cell products for clinical
purpose. You will lead a group of scientists (2+) and focus on platform set
up for stem cell isolation、characterization and differentiation;
preclinical standard set up for stem cell product... 阅读全帖 |
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b******s
发帖数: 1089 | 50 glycine主要是加在blocking buffer里。
要做好fixation，infiltration和embedding，剩下的问题才是抗体结合。前面几个步
骤对最后的成像也会有影响。fix的tissue大小如何，fix的充分与否，fix时stress严
重吗？比如你用4%PFA4度fix，小tissue俩小时足够。如果是大tissue，一定要slice之
后再fix。如果sample stress很严重，背景也会很强。如果以上做好的话，那就是抗体
的非特异性结合，用glycine pretreat应该可以减少一些背景。
用软件稍微加强对比应该没问题。confocal的自带软件，imageJ都允许这样。只要你不
是copy&paste，都没问题。 |
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