s******r
发帖数: 2876 | 1 福尔马林fix tissue，切片，觉得背景荧光挺多，
请问如何降低呢，google结果有用NaBO4或者Glycine的，大家的经验哪种比较有效？
另外请问可不可以用软件来减去背景荧光，可以用photoshop做吗？ |
b******s
发帖数: 1089 | 2 glycine主要是加在blocking buffer里。
要做好fixation，infiltration和embedding，剩下的问题才是抗体结合。前面几个步
骤对最后的成像也会有影响。fix的tissue大小如何，fix的充分与否，fix时stress严
重吗？比如你用4%PFA4度fix，小tissue俩小时足够。如果是大tissue，一定要slice之
后再fix。如果sample stress很严重，背景也会很强。如果以上做好的话，那就是抗体
的非特异性结合，用glycine pretreat应该可以减少一些背景。
用软件稍微加强对比应该没问题。confocal的自带软件，imageJ都允许这样。只要你不
是copy&paste，都没问题。
【在 s******r 的大作中提到】
: 福尔马林fix tissue，切片，觉得背景荧光挺多，
: 请问如何降低呢，google结果有用NaBO4或者Glycine的，大家的经验哪种比较有效？
: 另外请问可不可以用软件来减去背景荧光，可以用photoshop做吗？
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D*a
发帖数: 6830 | |
D*a
发帖数: 6830 | 4 专家来了，搭个车。
whole brain算是大的还是小的tissue？我看很多protocol是overnight的。
再请问可以比较overnight fix的和2小时fix的tissue的IHC结果么？还是会有很大差别。
sample stress是啥？
【在 b******s 的大作中提到】
: glycine主要是加在blocking buffer里。
: 要做好fixation，infiltration和embedding，剩下的问题才是抗体结合。前面几个步
: 骤对最后的成像也会有影响。fix的tissue大小如何，fix的充分与否，fix时stress严
: 重吗？比如你用4%PFA4度fix，小tissue俩小时足够。如果是大tissue，一定要slice之
: 后再fix。如果sample stress很严重，背景也会很强。如果以上做好的话，那就是抗体
: 的非特异性结合，用glycine pretreat应该可以减少一些背景。
: 用软件稍微加强对比应该没问题。confocal的自带软件，imageJ都允许这样。只要你不
: 是copy&paste，都没问题。
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b******s
发帖数: 1089 | 5 我不是专家。我也是一边做一边学。而且我不是做动物的，对于whole brain的大小没
概念。但是印象中PFA penetration的速率好像是1小时1mm左右，你自己可以估计一下
。我想多半还是太大，应该需要slice，并且需要4度overnight。小sample 2hr足够fix
的不必overnight，overfix也不好。但是好像很多人都是丢进fixative过夜。所以应该
区别也不大。但是最好是4度，否则cellular extraction和其他artifacts会比较严重
。sample stress在化学固定过程中或多或少，不可避免。除非高压冷冻迅速fix
sample。在电镜下会看的比较明显。plasma membrane会很wavy，一些organelle形态异
常，甚至aggregate。
别。
【在 D*a 的大作中提到】
: 专家来了，搭个车。
: whole brain算是大的还是小的tissue？我看很多protocol是overnight的。
: 再请问可以比较overnight fix的和2小时fix的tissue的IHC结果么？还是会有很大差别。
: sample stress是啥？
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D*a
发帖数: 6830 | 6 overnight是要4度，但是whole brain一般是不切，切了就找不到bregma了。
电镜没做过，good to know!
fix
【在 b******s 的大作中提到】
: 我不是专家。我也是一边做一边学。而且我不是做动物的，对于whole brain的大小没
: 概念。但是印象中PFA penetration的速率好像是1小时1mm左右，你自己可以估计一下
: 。我想多半还是太大，应该需要slice，并且需要4度overnight。小sample 2hr足够fix
: 的不必overnight，overfix也不好。但是好像很多人都是丢进fixative过夜。所以应该
: 区别也不大。但是最好是4度，否则cellular extraction和其他artifacts会比较严重
: 。sample stress在化学固定过程中或多或少，不可避免。除非高压冷冻迅速fix
: sample。在电镜下会看的比较明显。plasma membrane会很wavy，一些organelle形态异
: 常，甚至aggregate。
:
: 别。
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f*******e
发帖数: 628 | 7 这个问题真是不好答。
background 总会存在， 不影响 signal 的辨别的话，不用去除，直接处理 image 就
好了。
实在是要 physically 去除 background，就得知道是哪里产生的，sample，substrate
，reagent, buffer,microscope 都有可能，那就要对症下药了。 |
n***w
发帖数: 2405 | 8 我也来搭个车来说说自己关于不同条件的fix下的对于IHC的影响。
我是做眼睛的， 我做过如下的比较，
1. Whole globe: O/N fix in 4% PFA
2. Whole globe: 1hour RT in 4% PFA
3. Slit the cornea (more access to PFA) : O/N in 4% PFA
4. Slit the cornea: 1hour RT in 4% PFA
I compared immunogenicity of CD31 and PDGFRb.
Results were:
1>=4>2=3
As for the brain, I usually perfuse and fix with 4% PFA and post-fix in 4%
PFA O/N.
Today I didn't perfuse, I guess I may just leave the brains in 4% PFA for
36hours.
别。
【在 D*a 的大作中提到】
: 专家来了，搭个车。
: whole brain算是大的还是小的tissue？我看很多protocol是overnight的。
: 再请问可以比较overnight fix的和2小时fix的tissue的IHC结果么？还是会有很大差别。
: sample stress是啥？
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g*********5
发帖数: 2533 | 9 搭车问一下；
以前没有作过切片。这个有培训班吗？
准备做老鼠了，想学做些免疫组化的东西
谢谢。
【在 s******r 的大作中提到】
: 福尔马林fix tissue，切片，觉得背景荧光挺多，
: 请问如何降低呢，google结果有用NaBO4或者Glycine的，大家的经验哪种比较有效？
: 另外请问可不可以用软件来减去背景荧光，可以用photoshop做吗？
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n***w
发帖数: 2405 | 10 Does your institute have histology core?
If so, they should be able to train you.
【在 g*********5 的大作中提到】
: 搭车问一下；
: 以前没有作过切片。这个有培训班吗？
: 准备做老鼠了，想学做些免疫组化的东西
: 谢谢。
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s******r
发帖数: 2876 | 11 谢谢恢复，看到发表的图都是背景漆黑干净，一清二楚，反差明显，
不知道原始照片是不是就这么好，还是有专业的软件辅助处理照片。
不知道用Photoshop锐化图片算不算造假。
glycine主要是加在blocking buffer里。
要做好fixation，infiltration和embedding，剩下的问题才是抗体结合。前面几个步
骤对最后的成像也会有影响。fix的tissue大小如何，fix的充分与否，fix时stress严
重吗？比如你用4%PFA4度fix，小tissue俩小时足够。如果是大tissue，一定要slice之
后再fix。如果sample stress很严重，背景也会很强。如果以上做好的话，那就是抗体
的非特异性结合，用glycine pretreat应该可以减少一些背景。
用软件稍微加强对比应该没问题。confocal的自带软件，imageJ都允许这样。只要你不
是copy&paste，都没问题。
【在 b******s 的大作中提到】
: glycine主要是加在blocking buffer里。
: 要做好fixation，infiltration和embedding，剩下的问题才是抗体结合。前面几个步
: 骤对最后的成像也会有影响。fix的tissue大小如何，fix的充分与否，fix时stress严
: 重吗？比如你用4%PFA4度fix，小tissue俩小时足够。如果是大tissue，一定要slice之
: 后再fix。如果sample stress很严重，背景也会很强。如果以上做好的话，那就是抗体
: 的非特异性结合，用glycine pretreat应该可以减少一些背景。
: 用软件稍微加强对比应该没问题。confocal的自带软件，imageJ都允许这样。只要你不
: 是copy&paste，都没问题。
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s******r
发帖数: 2876 | 12 对，我就是想知道如何处理图片，能够变得更漂亮一些。
substrate
【在 f*******e 的大作中提到】
: 这个问题真是不好答。
: background 总会存在， 不影响 signal 的辨别的话，不用去除，直接处理 image 就
: 好了。
: 实在是要 physically 去除 background，就得知道是哪里产生的，sample，substrate
: ，reagent, buffer,microscope 都有可能，那就要对症下药了。
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n***w
发帖数: 2405 | 13 You can refer to this article:
"What's in a picture? The temptation of image manipulation."
http://jcb.rupress.org/content/166/1/11.full
【在 s******r 的大作中提到】
: 谢谢恢复，看到发表的图都是背景漆黑干净，一清二楚，反差明显，
: 不知道原始照片是不是就这么好，还是有专业的软件辅助处理照片。
: 不知道用Photoshop锐化图片算不算造假。
:
: glycine主要是加在blocking buffer里。
: 要做好fixation，infiltration和embedding，剩下的问题才是抗体结合。前面几个步
: 骤对最后的成像也会有影响。fix的tissue大小如何，fix的充分与否，fix时stress严
: 重吗？比如你用4%PFA4度fix，小tissue俩小时足够。如果是大tissue，一定要slice之
: 后再fix。如果sample stress很严重，背景也会很强。如果以上做好的话，那就是抗体
: 的非特异性结合，用glycine pretreat应该可以减少一些背景。
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s******r
发帖数: 2876 | 14 谢谢
You can refer to this article:
"What's in a picture? The temptation of image manipulation."
http://jcb.rupress.org/content/166/1/11.full
【在 n***w 的大作中提到】
: You can refer to this article:
: "What's in a picture? The temptation of image manipulation."
: http://jcb.rupress.org/content/166/1/11.full
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Z****9
发帖数: 738 | 15 对整体图片进行背景调整，增强对比度，不算造假（文章中要说明）
对图片的一部分进行调整，很多杂志不允许
【在 s******r 的大作中提到】
: 谢谢恢复，看到发表的图都是背景漆黑干净，一清二楚，反差明显，
: 不知道原始照片是不是就这么好，还是有专业的软件辅助处理照片。
: 不知道用Photoshop锐化图片算不算造假。
:
: glycine主要是加在blocking buffer里。
: 要做好fixation，infiltration和embedding，剩下的问题才是抗体结合。前面几个步
: 骤对最后的成像也会有影响。fix的tissue大小如何，fix的充分与否，fix时stress严
: 重吗？比如你用4%PFA4度fix，小tissue俩小时足够。如果是大tissue，一定要slice之
: 后再fix。如果sample stress很严重，背景也会很强。如果以上做好的话，那就是抗体
: 的非特异性结合，用glycine pretreat应该可以减少一些背景。
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g*********5
发帖数: 2533 | 16 thanks.
【在 n***w 的大作中提到】
: Does your institute have histology core?
: If so, they should be able to train you.
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h*******o
发帖数: 4884 | 17 For whole brain or hemisphere, what I did is to overnight fix them at 4oC.
Change to PBS with sodium azide for storage afterwards.
Make sure that your brain samples were perfused well.
Residue serum/blood is usually the cause of high background.
Also, block for longer time may help too.
Last take a 3D stack then get sharper images through deconvolution. |
