W*********n
发帖数: 775 | 1 请问各位大侠，
我想买一个抗体用，结果只查到一个抗体，用途说明中说可以用在dot blot 和 ELISA
及免疫组化中。只是没有说western blot中可用. 我没有做过dot blot. 请问这个可以
用在dot blot的抗体，一般情况下可否用在我的western blot上？浓度一般需要做如何
调整？
谢谢！ |
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b********a
发帖数: 79 | 2 放有northern blot hybridization tube的oven前有辐射吗？
我现在怀孕21周，在生化试验室工作。自己没有做过任何放射性试验，但试验室里有很
多人做。怀孕后我都倍加小心，但是今天竟然疏忽了！在一个oven边上前后累计操作试
验一小时左右，之后才发现oven里面有人正在做northern blot，而且中间还拿放
northern blot的玻璃试管两次！
发现以后真实后悔不迭。不知道这在oven前面放射性还大不，会对肚子里的宝宝有影响
不？ |
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h*********e
发帖数: 6997 | 3 目前用的是Bio-rad Trans-Blot Transfer Medium Pure Nitrocellulose membrane，
本来一张膜可以blot三四种不同蛋白，用三四次，最近不知什么原因不行了，有时blot
第二种蛋白，即使是b-actin都看不到条带了。而有些查看的蛋白和actin位置比较接近
，不好把膜剪了，这样的话想检测internal and loading control都不好办。
大家有没有其它膜可以推荐的？ |
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s********n
发帖数: 248 | 4 M-CSF培养的bone marrow macrophage，stimulate以后western blot 磷酸化的AKT/ERK
/STAT1，其他两个都blot的很好，但是pAKT总是没有想要的带，貌似出来的带都是二抗
结合的非特异性带。
请问版上高人，有blot过pAKT的没有？能否帮我看看问题出在什么地方了啊？
我用的WASHING BUFFER是TBST with 0.05%Tween 20，
BLOCKING BUFFER:5%BSA/TBST,
一抗就dilute在blocking buffer里边。
protocol:
室温block 1h，一抗4度过夜，洗3次×10min；二抗室温30min，洗3次×15min。
我初步怀疑是tween 20量加多了，又看到班上有用pbs做washing buffer的，貌似pbs更
温和一些，不知道用pbs会不会好一些？
小女子多谢了先！ |
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b*******3
发帖数: 99 | 5 膜蛋白做Western Blot需要用PNGase F去掉N端糖基?
我现在在做一个膜蛋白的Western Blot,这个膜蛋白的基因序列前辈被我加了一个FLAG
的标签构建立一个表达载体pcDNA3,然后转染到细胞HEK293中.筛选后构建了稳定的细胞系.
免疫染色,药理学都很正常.(如果没有转染成功不会有这么强的药理现象.)
抗FLAG的一抗,做Western Blot却做不出来.
是不是需要用PNGase F去掉N端糖基再做呢?有必要?
PNGase F去掉N-linked carbodydrates?和去糖基是一个意思?
谢谢
N-Glycosidase F (PNGase F) is a ~36 kDa amidase that cleaves at the
innermost N-acetylglucosamine (GlcNAc) and asparagine residues of high
mannose, hybrid, and complex oligosaccharides from N-linked glycoproteins. |
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l**********1
发帖数: 5204 | 6 RE LZ
GE Typhoon 9400 Multiplex Fluorescence Imaging Systems
HTTP: //www.biocompare.com/12406-Fluorescent-Western-Blot-Imaging-Systems-
Multiplex/471836-Typhoon-9400/
or
HttP: //www.biocompare.com/12406-Fluorescent-Western-Blot-Imaging-Systems-
Multiplex/3070068-Typhoon-Variable-Mode-Imagers/?ppim=3070068_6&ncatid=12406
more vendor:
HTTP: //www.biocompare.com/Bio-Imaging-Microscopy/12406-Fluorescent-Western-
Blot-Imaging-Systems-Multiplex/ |
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s*********y
发帖数: 292 | 7 请问ELISA灵敏度会比dot blot高吗？如果用同样的抗体
从来没做过ELISA，一直做western。最近碰到个蛋白很小，不太好跑胶。搜了搜网上的
ELISA kit，感觉这东西跟dot blot原理上一样的啊，但是特别浪费抗体。ELISA这东西
相对于dot blot有什么特别的优势么？ |
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c*********r
发帖数: 1312 | 8 也问个有关Northern Blot的问题
实验室需要做Northern，但之前没人做过。现在有500-1000bp的被Digoxigenin标记的
Anti-sense RNA探针。有Li-cor Odyssey的远红外检测的仪器。现在想找合适的试剂设
计一下怎么做，和大家讨论讨论。
方案1. 看了一下Roche的那个DIG NORTHERN STARTER KIT，最后用的是anti-
digoxigenin-AP。查了一下Odyssey的Fluorescent Reagent Compatibility，Odyssey
能检测NBT/BCIP，但是可能不能定量。
方案2. 抗体直接找一个Anti--digoxigenin-X，X能被Odyssey检测，比如IRdye，Alexa
680什么的。
方案3. 先找个一抗比如mouse/rabbit anti-Digoxigenin，然后用已有的二抗anti-
mouse/rabbit-IRdye680/800CW来检测，有点像Western blot。
还有个关于灵敏度的问题： |
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q**********0
发帖数: 335 | 9 Recently, I tried twice by using MEGAscript kit-making RNA Probes (32P-label
GTP and incorporated) in sourthern Blot. However, all failed. The probe is
single-stranded RNA, it should blot the DNA template. I don't know what's
wrong with it. Anybody have the experience on this? Please help. Thanks. |
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m*********7
发帖数: 5207 | 10 前两天作WB。因为蛋白在细胞里丰度很低，所以用的是GE healthcare生产的ECL plus.
结果曝光时间不到5秒，整个blot就全黑了。通常这种情况下，我会等信号自然衰减，
大概2-4小时之后再去darkroom.但那天因为急着接孩子，我就突发奇想，把那张已经曝
光了的片子放在blot上，但是避开黑色的部分。把新的片子压在旧片子的上面，曝光十
秒，出来条带非常清晰。
反正那张废了的片子不用白不用，正好可以屏蔽信号。而且这样做也省时间。不过如果
你用phospho-imager，就不知道这招能不能用了。 |
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l********g
发帖数: 26 | 11 用DNA做Dot blot，之前做的时候一直没啥问题，
忽然从某天开始，曝光的背景噪音高的无法接受，黑乎乎的。
buffer用的1XPBST。更换了所有的试剂和膜都没起色。
有没有大牛share一个好的Dot blot的protocal或者指点一下如何才能
降低背景噪音？antibody我已经尽可能少的加了，不能再减了。
谢谢！ |
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m******5
发帖数: 1383 | 12 I am doing southern blot using these system listed combined
invitrogen iblot system + Roche Dig labeling + IRDYE 800 southern blot
Now the problem is , I got unwashable high back ground under either 700 and
800 spectrum
Could anyone en-light me a bit on what is going on in my system? |
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E*********s
发帖数: 93 | 13 Do you know how long I can keep the southern blot after uv crosslink before
hybridation?
The blot is wrapped in filter paper in RT under vaccum, it that the right
condition to store it?
Thanks! |
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m*********7
发帖数: 606 | 14 第一，你的tissue lysate测了总蛋白浓度没有？
第二，如楼上所说，你既然要做Western blot，为什么不用Western blot的常规方法用抗体去检测持家基因的表达量？
第三，谁能告诉我那些状如小气泡的东西是什么啊？难道是你的胶上就含着这些气泡？
第四，为什么这块胶泡了１０个月你才来问上样量可不可比？
第五，你为什么会认为别人能够目测蛋白浓度，就凭这张照片？
第六，５００ng蛋白接近commassie blue染色检测的下限了（有文献说下限为0.3-1ug/lane，与染色条件相关），你看不见也属正常。 |
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H****s
发帖数: 301 | 15 (1). Spot your cell lysate (or culture supernatant) onto nitrocellulose
membrane. 2-5ul is good enough for each spot. Positive and negative control
is a must.
(2). Let it sit on the bench to dry. 20 minutes is more than enough.
(3). Block with 5% milk or BSA at room temp. 30 minutes. Gentle shaking.
(4). Add your primary antibody (let's say mouse monoclonal antibody) to the
milk directly. Room temperature 2 hours (or cold room overnight). Gentle shaking.
(5). Wash three time with 1XPBS. 15 minut... 阅读全帖 |
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b******r
发帖数: 111 | 16 Note: NHEs is membrane proteins that transmembrane 12 times. NHE5 is
localized to the plasma membrane;NHE6-9 reside on organellar membranes(
endosome,Golgi);
1. pcDNA transfects NHE5-9 through Fugene 6(ratio is 3 uL of Fugene/2 ug of
DNA) in 293 cells. After three days,collect cells.
2. Cold PBS washes cells. Add 150 uL of lysis buffer(final concentration:
50mM Tris pH7.4, 150mM NaCl, 1% triton, 0.1% sds, cocktail inhibitor)
into each well of 6-well plate. Scrape cells.
3. The lysate gets st... 阅读全帖 |
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s******a
发帖数: 472 | 17 I used Amersham Direct Labeling Kit for my southern blot, and the protocol
is basically the kit manual. However, I have now a reproducible problem. As
shown in the blot, I expect a specific band in digested genomic DNA, but all
I have is a big smear (inside which there seems to be a band higher than my
target band).
I might have at least two problems:
1, the probe is bad;
2, the digestion is incomplete;
I kindly ask you to give me some advice regarding trouble shooting and how
should I proceed.
... 阅读全帖 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 18 if that PCR mutation coincidencely happend on the key ponit or region of the
binding sites between that
probe and Genomic DNA sample, which is simialr to loss of docking site in
Western Blotting , then how can you expect both bind tightly unless p32 or
s35 etc isotope labelling can pick weak binging up but Dig labelling Can't
pick that kind of weak binging.
And after sub cloning that the slected white clone can keep your probe
almost no changed and inserted into that vector with LacZ gene of β-
... 阅读全帖 |
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s******n
发帖数: 63 | 19 实验室一个成为faculty的大大大师兄送给我们一种KO小鼠，是他自己做的，但是他说
只能用southern blot来鉴定杂合和纯和，因为敲掉的这个基因在基因组上有一些高度
同源的序列，他自己设计了15对引物都没有找到一个特异性好的........
但是我不想做Southern Blot啊啊啊，主要是要摸索，而且要花好多时间啊。。。
想问真的没有其他的办法了吗？ |
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h*****G
发帖数: 113 | 20 hello, 各位大牛好。最近做了几个knockin的reporter line，需要检测是否有random
integration。看了一下都是用Southern Blotting, 但是我们组因为不做southern，基
本的东西都没有，比如hybridization oven。就想问一下，有没有其他的方法可以检测
，如果没有，有没有什么公司提供Southern blotting的service的。谢谢。 |
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j*******k
发帖数: 187 | 21 在读研究生，怀孕两个多月了，最近老板有打算让我做一些western blot的东西，想请
教下有类似经验的宝妈们，知道跑胶的一些东西比较有毒，但是不是只要带口罩和双层
gloves就好了，还是最好都不要做呢？还有每周都要用到一次radioactive 的isotope,
hydrogen -3 [tritium].每周剂量大概0.2 mCi左右，不知道这个可以接触吗？ 在公
司里面做的实验，看其他怀孕的女生都没有特别忌讳的，照样做，但总有点不放心，所
以上来请教下。谢 了！ |
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C*******7
发帖数: 35 | 22 My friend did Western Blot and her baby is fine. But I am not sure about
radioactive isotope. |
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j*******k
发帖数: 187 | 23 多谢大家的回复.UPDATE一下，咨询了公司的health center和radio safety的部门，就
western blot来说，就像大家提到的，做好口罩和GLOVES的基本措施就好。关于3H,是
不会有任何external radiation.一张纸或者衣服都可以完全隔绝。只要不粘上皮肤就
没事。口罩都不用带。就推荐穿double layer的lab coat和gloves，因为是有可能穿透
单层的gloves的。希望对其他也有类似问题的MM有帮助。 |
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b****a
发帖数: 37 | 24 想在BOSTON地区找一个实验室, 免费安装一台荧光化学发光成像仪, 此仪器比较适合
做WESTERN BLOTTING等实验的结果分析. 唯一条件: 仪器能被频繁使用. 如果您已经有
BIORAD或其他公司的仪器, 作为对比效果会更好.
免费使用期限：２个月至 永久（面谈）． 无需您反馈使用的具体信息（有反馈更好
）， 除您同意外，不会带其他客户来参观贵实验室．
需要资料的话，可站内联系，或发邮件到b****[email protected]. |
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b****a
发帖数: 37 | 25 想在BOSTON地区找一个实验室, 免费安装一台荧光化学发光成像仪, 此仪器比较适合
做WESTERN BLOTTING等实验的结果分析. 唯一条件: 仪器能被频繁使用. 如果您已经有
BIORAD或其他公司的仪器, 作为对比效果会更好.
免费使用期限：２个月至 永久（面谈）． 无需您反馈使用的具体信息（有反馈更好
）， 除您同意外，不会带其他客户来参观贵实验室．
需要资料的话，可站内联系，或发邮件到b****[email protected]. |
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M****e
发帖数: 70 | 26 you should set constant VOLTAGE instead of CURRENT.
i use semidry from BioRad, and it works very nice for my
western. set to 15V, transfer @ RT for 1hr to 1.5hr. i never
think that all the protein could be transferred onto the
membrane. and thus to make a homogenous sandwitch is very
important, which means that you treat the gel, the membrane,
as well as the blotting paper very equally well.
think about this, it is the electric field that pushes the
charged molecules to move rather than the curr |
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M****e
发帖数: 70 | 27 if you are look at splicing events and you definitely would
like to use northern blot, though technically it might be
difficult. RTPCR is more sensitive for quantitation of total
messages, or you can actually design primers for alternative
splicing products to specifically measure them in a total
population of mRNAs. i like RTPCR since it is quick to roughly
estimate changes for steady level of RNA. and sometimes i do
semiquantitative RTPCR, which means that i stop the RXN before
it reaches the |
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M****e
发帖数: 70 | 28 my point is to make sure that you have transfer of good
quality and quantity of RNA onto the blotting material.
the washing stringency for your experiment is not quite
high (i.e., 42C). i think the problem is mainly due to
bad RNA or probe. if there is a lot of radioactive
nucleotides incorporated into the probe, you should
detect very hot signal after purification. denature the
probe before use. GAPDH is a housekeeping gene that is
typically used for normalization of load. i suggest you
read a |
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d*****r
发帖数: 2583 | 29 ☆─────────────────────────────────────☆
muhe1985 (沐河) 于 (Tue Jan 6 14:34:09 2009) 提到:
我手头有一些很重要的western blot结果，但是我用的一个无法替代的抗体总是产生十
分肮脏的灰色背景（遍布整个胶）
听说imagin J可以自动识别特征条带，直接去掉全部背景？不知道要如何操作
☆─────────────────────────────────────☆
DrBiologist (Publish or perish) 于 (Tue Jan 6 19:29:39 2009) 提到:
This is not a good practice. It's OK to have a "dirty" background.
☆─────────────────────────────────────☆
wsmajia (为了爱情认真努力的人) 于 (Sat Jan 17 23:06:50 2009) 提到:
试试放在窗子的玻璃上用相机拍。
以前我们有个重要的WB结果用 |
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v*******3
发帖数: 119 | 30 刚刚从生理变成了分子的人
问问
看到很多文章作了western 后southern blot之后，最上面有一个三角形，不知道什么
意思
还有什么是ligation-mediated PCR
多谢多谢 |
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h*********e
发帖数: 6997 | 31 自己顶。
没有人做western吗？
blot |
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a****d
发帖数: 1919 | 32 前段时间版上讨论 Licor Odyssey，请问熟悉imager的各位，licor odyssey， storm
imager(GE), 还有Bio Rad的imaging system， 哪个最好用？
我一直用film，但是最近暗房被拆了，杯具。。。lab里面有一台 Bio Rad 的imaging
system,我很不喜欢用，感觉远不如film sensitive，而且背景也高。
现在考虑是否有必要催boss换一台imaging system做western blotting，请熟悉这方面
的推荐一下。 |
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N***P
发帖数: 153 | 33 最近做western blot，肌肉里面的GAPDH都是两条平行的带，中间间隔1毫米。
有人见到过这种情况吗？ |
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N***P
发帖数: 153 | 34 从一个肌肉样本提的总蛋白，分装在-80度。western blot两次。加了抗体，不到1分钟，两条
带就显示出来了。
另外我也尝试了跑胶，不转膜，直接coomassie blue染色。Coomassie blue染色后，在
Tris-HCl胶上相对应的地方，也是两条清晰的带。 |
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g*******6
发帖数: 1034 | 35 大家现在flourescent southern blot都用什么kit呀？是不是还用Roche的，都很多年
没做了，不知道有没有什么更新换代的产品。
不想用同位素，免得给人骂，有什么好的替代？ |
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c******y
发帖数: 148 | 36 我们做的是bluenative page， 1st dimension跑完之后，用1*SDS loading buffer
loading dye> with 100mM DTT 室温浸泡1h，之后按照正常western blot处理 |
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h******y
发帖数: 1374 | 37 很珍贵的细胞pellets，准备几个时间点做完之后就一起提蛋白做western blot实验。
我们一般是用PBS加Sodium vanadate(SV)刮细胞，然后离心吸走多余的液体把细胞
pellets冻在－80冰箱。一个学生离心完之后忘记吸除PBS和SV，就冻上了。请问这样会
不会对以后提蛋白有什么影响。如果有的话，看来得需要重复实验了。
谢谢！ |
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D****g
发帖数: 275 | 38 Roche Northern blot start kit
It is good for me. However, there are somethings you should kept in mind:
Even they said that it is as sensitive as P32, but radioactive method stills
is the most sensitive method, it is good for abundent gene, if the gene
expression level is lower and the probe is short, you should try P32 first. |
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g******u
发帖数: 66 | 39 今天在显影的时候不小心把membrane和film一起带进developer里面了,由于还想re-
blot下一个蛋白,不知道membrane 过了一次那个机器后还能不用再利用了.谢谢! |
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h*******g
发帖数: 91 | 40 一般抗体买来的时候都是在含有HEPES, BSA和sodium azid的buffer
今天不小心用di water稀释了后，再分装，然后放到-20保存
请问对以后western blot的试验结果有关系吗？
另外，以后实在要稀释后分装，应该用什么溶液?
感谢各位！ |
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C*******e
发帖数: 4348 | 41 我们用bio-rad的chemidoc
报价$40k，最后是<$30k拿下来的
包括全套filter
不过用的时候只有两个filter插槽
但对我们实验室的应用影响不大
以前我还用过bio-rad的versa doc，那个更大更贵一点
不过我觉得chemidoc够用了，而且他们配套的软件做得不错
很多fancy的功能
不过我们基本都没有用那些fancy的东西
另外还让alpha image过来做过demo
他们的报价$25k左右（好象是，记不清了，反正肯定小于$30k）
比chemidoc还小一点
有5个filter的位置
他们的配套软件要差一点
不过我估计真的用起来的话应该该有的都有了
不记得可不可以“merge”了，就是同一个blot两张照片（比如不同filter）overlay到
一起
如果对你们是个必须，最好问清楚 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 42 恩，我说的两个都是蛋白胶，核酸胶，western blot都可以照的 |
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c********u
发帖数: 250 | 43 今天做western，blot with anti-atubulin as loading control,为毛所有其它tissue都
好就是liver一点点信号都没有啊，俺用的是RIPA buffer to homogenize tissues，谢
谢先 |
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e****p
发帖数: 354 | 44 做Northern blot， 看到清楚的目的条带，
但18S 28S位置上的有很强信号，查了PROBE并无太大同源性，PROBE 1400BP大小，用的
20ugTOTAL RNA
重复做了还是这样，有没有遇到这样的情况。有什么好办法?
多谢各位大虾 。。 |
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w***z
发帖数: 1158 | 45 也碰到过这个问题。
用质粒做模板标记探针，针对同一基因做了2条探针，其中一条探针blot后只有特异条
带，但另一条除了特异条带外，18 28S也都有。总RNA和mRNA都试过，结果相似。 |
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m******5
发帖数: 1383 | 46 我觉得western blot定量用肉眼就行…… 关键是要有好的梯度 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 47 做一个western要两天？？
anyway，要做dot blot的话不推荐用pvdf，用nc的比较方便
另外如果有vacuum blotter那做出来就很漂亮了 |
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s******y
发帖数: 28562 | 48 有的机器能够跑四个不同的blot :)
其实就是有四个chamber.
而且对于用Licor 系统的人而言，一般都是用两个抗体，一个目标，一个内参，
同时用。所以大部分情况下一个chamber 就够了。呵呵。
如果有几个博士后后要做不同的项目的话，那么就轮着用好了，
就跟PCR machine 一样，大部分实验室也是轮着用的。 |
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V***b
发帖数: 3419 | 49 跑胶要自己做吗？如果 跑胶-转膜-封闭-加抗体-洗膜-曝光-定量-作图 一条龙就好了。这机
器还真有哇，我一直觉得是不可能实现的。
要是只能做转膜-加抗体-洗膜就没太大意思了，这部分工作量不是太大，而且估计一抗
，二抗，洗膜液，ECL，还得人来赔。
要是一切在电脑屏幕上点一点就好了。做一个western blot 5分钟。关键还得看质量，
最后出来歪歪扭扭的band就没意思了。 |
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a****l
发帖数: 125 | 50 western blotting 有时定量不精确，不太大的变化有是看不出来。有什么更敏感的方
法呢？
谢谢 |
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