s**********d
发帖数: 1694 | 1 我要富集CD4-CD8- 的thymocytes,现在有两个办法，一个是sorter另外一个是MACS的
magnetic beads.我认为sorter的激光照射还有非常急的stream可能对细胞有伤害，而
macs因为是手动操作可以减少对细胞的伤害。但我老板说，magnetic的beads对细胞也
有伤害。不知有没有人有这方面的经验，能谈一下吗，谢谢了。 |
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m******5
发帖数: 1383 | 2 overexpression的蛋白被beads，如谷胱甘肽偶联或者Ni+偶联beads大量吸附后上样，
浓浓一砣，请问大家认为此时是上边缘高于实际分子量呢，还是下边缘低于实际分子量。
和朋友讨论了一下，认为如果用分子筛模型来思考，应该是上边缘高于实际分子量，下
边缘对齐实际分子量并略向下migrate一些
有什么别的模型能处理这个问题？ |
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w******e
发帖数: 1187 | 3 想搞点他们的beads来试试multiplex，居然被告知他们的beads只在luminex system
里work，不适用于FACS。。。靠难道他们的system不是基于flow cytometry的嘛。。。
同时借问，还有没有什么公司生产>4种不同颜色，其他规格一致的magnetic
microbeads
吗？多谢！ |
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w**t
发帖数: 52 | 4 Input的量应该很好控制吧，一般的endorgenous protein而言total protein
concentration一样就好。IP的量就要看wash的过程有没有损失beads了，可以run1，
2ul看IP的量或IgG的量可以大概比较出该load多少。
至于艳阳MM的方法，不愧是做生化的高手，不过beads的量少的话也可以这么做么？而
且做得多的话（比如十多管IP），可能还是传统方法好handle吧。不过这种方式确实是
损失很小。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 5 beads 量太小（少于50uL) 可以加适当的blank sepharose beads来填充体积。
管太多的时候就像你说的那样，挺麻烦的，特别是装那么多column很烦，特别
耗时间。不过装完之后就好了，可以把所有column 都装在那种Qiagen rack 上，
一起洗，其实还蛮方便的。我最多的时候同时做过8管。
另外，你指出这个是对的：在大部分情况下的确是可以用IgG 来做loading control。
用这个矫正体积后再跑胶。
我们实验室经常是做crosslinked IgG, 没有办法用这个loading control，
所以我一下子还真没有想到这一点。 |
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d*p
发帖数: 534 | 6 那个多个Beads mixture德，每个识别一种，每种beads的size不同， 直接FACS就可以
了，忘记那个公司的了 |
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m******5
发帖数: 1383 | 7 最明显的应该是beads上蛋白拿到一大堆
蛋白产量高的话轻易就能饱和beads,很难看出来的 |
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n***w
发帖数: 2405 | 8 嗯，有可能饱和了。
我昨天把1st binding后的supernatant又加beads了，看好没好些今天。
我觉得N-lau还是挺好使的。能solubilize大部分pellet。
我500ml的culture提了差不多160ug的蛋白。。。
我下次买点你说的B-Per试试好了～ （不过看成分也差不多）
我现在的protocol基本上是：(For 500ml culture)
1. thaw pellet on ice
2. add 18ml GST buffer (配方见上)，add 1% PI, add 2ml lysozyme (10mg/ml)，
mix on ice for 30 seconds
3. pass thru 20G syringe to reduce viscosity, also add DNAse 40ul (1mg/ml).
4. sonication (it will become clear)
5. 10000rpm, 40min，4deg
6. collect supernatant for GST beads binding
不过我这次还是将G... 阅读全帖 |
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h*******n
发帖数: 2052 | 9 如果要用Co-IP证明两个蛋白的相互作用， 请问下面几个因素对实验结果有影响吗？
1. spin down Protein A beads时的离心速度， 是不是不能太快？
2. 洗beads的次数， 洗多了怕把蛋白洗掉了， 洗少了怕背景高， 请问洗几次好？ |
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s******s
发帖数: 13035 | 10
看你用啥beads了
，rtfm
洗多了没啥问题，只要beads不丢。关键是buffer的强度 |
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n***w
发帖数: 2405 | 11 我对我自己已经很无语了。
之前已经说了提蛋白，用beads，然后必然就是purification了。
我用的是pGEX2T，所以使用thrombin来切掉GST-tag来释放my protein of interest。
室温切o/n。
然后用cold 1x PBS (pH 7.3)洗脱，奇怪的地方是，极少极少的蛋白被洗出来，几乎所
有的protein of interest还是在
beads上。。。。
大家可以看附件，下面那个一大坨是GST, 上面一个一大坨就是我想要的蛋白。。。。
我不知道该怎么办了。。。。
大家一起帮我troubleshooting一下吧，希望有前辈以前遇到过类似的问题。
用google搜出了一个这个帖子，情况和我很类似，但是貌似最后也没有什么办法。。。
最后一楼的方法我在犹豫要不要试
一下。。。
http://www.protocol-online.org/biology-forums/posts/5431.html
非常感谢！ |
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g*****p
发帖数: 451 | 12 这年头做蛋白的人怎么这么多...
你这个蛋白问题挺大的，本来性质就不是特别稳定，不容易在溶液中单分散
由于你用了gst，所以使其溶解性能增加了
你的gst beads实际上是agarose尾巴上接14C左右的碳链
然后再锚定谷胱甘肽
你的蛋白如果疏水区外露的化，很容易就跟这些碳链骨架的beads搅合在一起了
所以你的gst能带着就尽量带着吧
不过gst是一个dimer，如果你的蛋白活性对聚集状态没有什么要求的化，就用这个好了
如果有要求可以换个mbp啥的
如果纯化出来除了做做pull down等等还有其他要求，比如mg啥的
最好还是做些mutant,truncation也行，fusion protein, 也行，把hydrophobic
residue
一路突变过去找个不影响活性又能增进其稳定性的亦可以
BTW:你这个蛋白我怀疑已经是soluble aggregate了，最好还是先不去除tag，把蛋白稍
微纯化一下，用gel filtration或是光散射看一下
soluble aggregate对你没啥太大意义了，就算测出来点活性。以后成文，你要在文章
里耍赖不提还好，一旦提到sol... 阅读全帖 |
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t********n
发帖数: 64 | 13 最近做Co-IP，beads用的是GE的Protein G Sepharose 4 Fast Flow，结果发现用的和
我目的抗体同源的IgG也能拉下目的蛋白来，我怀疑是beads的作用，大家有遇到过这种
情况吗？ |
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s******s
发帖数: 13035 | 14 标准protocol都应该有吧，用beads不加antibody先把背景去掉，然后
再加antibody新beads |
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l*******1
发帖数: 128 | 15 I think you might need to do consecutive affinity column/pull down. Let's
say you tag your A, B, C, D with GST, V5, His, and HA.
You can start with GST-fused A to pull down the A-containing complexes.
Then pass the elution to V5-tag beads, elute the presumed A&B containing
complexes with V5 peptide. Pass the A&B containing complexes through His-
tag beads, elute the ABC complex with imidazole.
Use Western to probe the original sample and each elution for those 4 tags.
Of course, you can chang... 阅读全帖 |
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n***w
发帖数: 2405 | 16 搭车问一下，
1、有用过GST magnetic beads的吗？有的话给推荐个～
2、发现蛋白和agarose beads interaction，有啥办法把蛋白洗出来不？
谢谢。 |
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e****s
发帖数: 1125 | 17 蛋白死在柱子上太多了。
不管什么柱子，你把蛋白洗脱以后，用Sample Buffer泡一下Beads，都会有一定的目的
蛋白残留在里面，这些蛋白很难被正常洗脱，死在Beads上了。
GST tag溶解性增加，去Tag后可能更不稳定，甚至有什么Soluable inclusion body的
说法。GST非要切掉吗？ |
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y*********u
发帖数: 183 | 19 可能以前我比较土，后来因为chip完全没做过所以四处问于是听说了 |
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y*********u
发帖数: 183 | 20 能推荐一款kit配合dynal进行chip用么？ |
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l******n
发帖数: 298 | 22 他们那个beads是怎么做的，能不能自己研发搞类似的产品。
还有一个问题就是共价键抗体怎么结合到beads上面去的呢？ |
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w******e
发帖数: 1187 | 23 请教：用cell-free expression synthesize peptide/protein, 要求newly synthe-
sized peptide/protein自动被immobilize到beads上，并达到尽量高的copy number。
最直接的方法大概是在gene里加个FLAG/HA的sequence，beads上coat FLAG/HA
antibody。但Ab个头太大担心copy number上不去。
请教有什么alternative method？比如his6-peptide的coverage会不会更高？
比如有没有site-specific biotinylation的reagent可以跟cell-free expression
合用？
非常感谢！ |
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s******y
发帖数: 28562 | 24 6xHis 不是一个好选择，因为非特异结合非常严重（其实也不是真的非特异，
而是细胞裂解液里的好多蛋白本身就能结合金属离子）
你说的copy number, 是指每个bead 上被固定的多肽的数目吧？这个应该说
是“表面浓度”。
Antibody 的个头其实不是问题（再怎么大也超不过20nm)，而是cross-linking
efficiency 会是大问题。
如果这个对你们真的很重要的话，可以用GST-fusion protein + Glutathione-beads |
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w******e
发帖数: 1187 | 25 多谢建议！
是这个。说copy number是每个beads上要coat不同的peptide。btw有什么好方法
测peptide浓度吗？如果已知peptide的部分序列的话
这个倒不知——ab biotinylation应该有满成熟的protocol吧？问题是我希望
每个beads（1到几um直径）上coat至少1e4 peptide,最好1e5以上。。。
要做一个peptide library的话，有点担心用GST做constant tag会不会太大？
有没有可能modification-by-synthesis的方法，加入一个biotin-AA analog，只在
某个位置incorporate的？继续伤脑筋ing |
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g*******f
发帖数: 427 | 26 最近在做一个转录因子的 ChIP, 用的是 Richard Young 的protocol, 可是 IgG IP 的
在有的sample总是有很强的信号，当然也有的 sample IgG pull down 下来的很弱的。
我想请教一下如何降低这种non/specific binding, 我用的是 invitrogen dynabead。
以前用过 millipore agrose bead ,记得 agrose bead 要用 salmon sperm DNA block
的，我想请问一下有没有人用salmon sperm DNA block dynabead。 问过 invitrogen
technical support，他们不推荐，但是也说不出个理由，只是没有人这么做过而已。
如果有人试过不行，那我也就不必试了。多谢 |
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d****7
发帖数: 109 | 27 IgG本来就不是什么好的control，我们做ChIP时，不仅用IgG，还用negative region
primer做control
对于ChIP下来的DNA，这个跟你的蛋白的表达量，IP的细胞数有关，比如我的TF表达量
很低，我用20碟10cm dish才ChIP下来10ng DNA，如果是histone的话，估计会很多。
对于Protein G，我这有个鼠单抗，是IgG1，与protein G结合的一点也不好，必须用另
一种beads，叫Pan Mouse IgG Dynabeads，这个beads是pre-conjugated human
monoclonal ab to mouse IgG，结合的不错。但让我费解的是，同样是鼠单抗，同样是
IgG1，Flag M2抗体就和Protein G能perfectly结合。
Rabbit |
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K***6
发帖数: 155 | 28 老板不太了解细节，只交待了一个大方向：找合适的human serum albumin的抗体，自
己pack一个可以装在HPLC的柱子，用来分离血浆里面的albumin;还交代在pack之前，先
用IP Kit试试不同家的抗体，看哪家最好。
我的问题：这个pre-pack的柱子，有包含相应的 resin/bead 吗？若是分别买，怎么样
才能配套？还有,老板讲的IP需要做吗？还是直接买不同的抗体，和resin/bead 混在一
起，然后过柱子？有推荐的Vendor吗？ |
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q****2
发帖数: 208 | 29 按我得经验 减半没啥问题 或者你可以单独再去买Salmon Sperm DNA /Protein A
Agarose beads。
Salmon Sperm DNA /Protein A Agarose-50% Slurry就是50％的beads 50％ buffer（
其中包含了一定浓度的Salmon Sperm DNA） |
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k****o
发帖数: 589 | 30
用DSS是为了让抗体不被洗脱，以后还可以重复用agarose beads。交联这一步我是严格
按照厂家的protocol做的。Elution buffer根据厂家描述是酸性，pH2~3。洗脱应该是
没有问题的。洗脱后没有中和pH,但是厂家说这样没有问题。细胞裂解用的是Cell
Signaling的lysis buffer，用来做相同蛋白的WB从没有问题发生过。
你是建议我用Laemmli Sample Buffer洗脱吗？这样即使洗脱，agarose beads也无法重
复用了吧？ |
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h*******o
发帖数: 4884 | 31 我们实验室都是用得bead homogenizer来打碎组织的
根据组织不同用不同材料和大小的beads,和tissue一起放在trizol里面打 |
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A******y
发帖数: 2041 | 32 You need to cross-link your ab to your beads, magnetic beads work best but
some antibodies can not handle the cross-link. You also need a lot more
antibody ~100ug and a lot of cells for native pull-down. I use one T-25 for
native IP. |
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h******t
发帖数: 56 | 33 多谢回答,我用的beads是invitrogen的untouched monocytes isolation beads，而且
cd14 positive cell 有96%+这么高, 所以我觉得应该没有多少T cell contamination. |
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l*****5
发帖数: 197 | 34 大家好，现在遇到一个问题不知道怎么解决，希望在此得到帮助，不甚感激！
我用recombinent protein 做一个in vitro assay，最终希望得到一个比较纯，浓度比
较高的dimer，所以一个是His tag，另外一个是GST tag，计划用两次纯化得到最终产
物，其间涉及到另外三种enzyme,实验室以前别人做的，都是His tag。
按理说，整个反应的过程没有多大难度，有一些文章也有receipe，但因为我需要的是
最终的产物，然后再接着往下做别的，所以希望能做的多一些，也需要浓度大一些。但
我已经试了3、4次了，基本上每次做都会缓慢的出现絮状的沉淀，就好像蛋白变性的那
种感觉，会不会是我用的反应浓度比paper上的浓？但我需要的量比较大啊。。。lab以
前的师兄做过，效果还可以，我的浓度是他的5倍，而且总体的量也多很多，他以前做
的量都比较少，也不需要纯化之类的，师兄毕业走人了，而且他一直就用比较稀的浓度。
还有，我试着将离心后的上清过Thermo Pierce的glutathione agarose beads,可以看
到蛋白有吸附（有YFP tag），但我最后... 阅读全帖 |
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l********s
发帖数: 70 | 35 我们可以讨论，这两天在做CHIP，你买 Cell singalling 的beads，我觉得挺好用。里
面把bsa什么的都是ready to use
另外我建议，用1mm glass beads 在计入125mM glycine 以后，打晕组织再次，打个6
次，中间休息1-2min 放在冰上。 trypsine 可以不用。 我这里些个protocol 可以给
你，07年nature protocol 有个 fast chip 你就可以借鉴
qq 53671616 |
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H****n
发帖数: 26 | 36 多谢beads的信息。其实我也怀疑这个milipore 的beads不给力。已发送qq好友申请。
呵呵。
6 |
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w******u
发帖数: 17 | 37 蛋白solve在8M urea,
最后试过用1M imidazole, 1M imidazole+50mM EDTA,大部分蛋白还是在beads上。
估计蛋白stick在bead matrix上，
大家有什么好的办法解决这个问题？ 谢谢！ |
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W****C
发帖数: 1937 | 38 以前实验室有人做过， 把细菌培养物扔给培养的巨噬细胞然后收集划板数克隆。 还可
以用beads模拟， 用流式测吞噬的beads。 |
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c*********0
发帖数: 923 | 39 Engineering bacteria to manufacture functionalized polyester beads
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Volume 3, Issue 4 July/August 2012
Pages 203 - 208
http://dx.doi.org/10.4161/bioe.19567
Keywords: PHA, PHA synthase, PHB, bacterial inclusions, beads, biopolymer,
bioseparation, polyester, polyhydroxyalkanoate, vaccines
Authors: Jenny L. Draper and Bernd H. Rehm
please send to q*********[email protected]
thanks so much |
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s*****a
发帖数: 59 | 40 His-tag protein was overexpressed in HEK293 cells.先用IP 纯化，接着做His-
purification变性条件来第二轮纯化（此顺序是实验需要，不要问为什么）。目前结果
是第一轮IP很好，但是His-purification后蛋白都在unbound fraction. 我用的是
Qiagen Ni-NTA Magnetic Agarose bead,据说适合纯化含量比较少的比如mammalian
cell的蛋白。IP后的蛋白都经过 buffer exchange，也没发现有与Ni resin
uncompatible的成分。请帮忙trouble shooting。会不会因为蛋白浓度太低导致与Ni
resin结合不好？His-purification有没有target protein concentration threshold?
是否需要改用binding capacity更大的Qiagen Ni-NTA agarose (不是magnetic bead)？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 41 一般来说。。。如果纯蛋白能溶的话，一般都是折叠正确了的。
当然也有例外。比方说如果带电量很强的话，有时候会出现所谓的soluble aggregate
，就是单独的情况下能溶解，但是一碰到什么核心立刻就纠缠起来沉了。
你这个情况听起来有点象这个情况。
既然你说了A蛋白用GST-bead的话会导致迅速aggregate, 你是否试验过把B蛋白先
cross-link 在什么bead 上，然后去结合低浓度的纯化之后的A? |
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b******y
发帖数: 627 | 42 My guess is that A protein is probably multivalent, i.e. one A protein can
bind more than on B. Even if one A can only bind one B, GST is a dimer and a
GST-A dimer can bind two B and increase the local concentration of B.
Furthermore, Glutathione bead substantiates the local concentration effect
by binding more than one GST-A dimer in the vicinity of each other. As such,
the self-assembly activity of B is greatly increased and the whole system
including all beads, all GST-A and all B forms a sin... 阅读全帖 |
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b***g
发帖数: 110 | 43 go for ampure beads or biotin beads. lots of labs are using them in bulk. |
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d********r
发帖数: 211 | 44 CD3/CD28 beads are 4.5 μm diameter, not too small. (see in the link below)
http://products.invitrogen.com/ivgn/product/11161D
Also I think they are using 3:1 ratio.
Some information suggests that transduction may happen better when the cells
are being activated, so they may want to have the beads there...
Not sure...
T |
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s******s
发帖数: 1584 | 45 啊对的。但是我没有比较过pull down efficiency, 就是同样多的magnetic beads 跟
flag conjugated agarose哪一个pull down 更多。但是杂带肯定是magnetic beads少
很多。 |
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g*******f
发帖数: 427 | 46 我最近在做一个蛋白的 SUMOylation, 用SUMO1(D-11)(SC5308,santa clus) 来IP,然后
用我要做的蛋白的抗体 blot,用的是 Dynabeads Protein G. 但是 没有任何 SUMOed
蛋白的带，但是比我的目标蛋白size 小的位置有一条很浓的带，我怀疑是从beads上
elute 下来的东西，会不会是IgG呢？
附图从左到右 lane 1－4： 不同处理的样品 用SUMO1 IP后用目标蛋白抗体blot; lane
5-8 是相应的 input; lane 9-12 是ip 后用 bead collect 后的 leftover。
从图上看IP 的样品在目标蛋白的位置没有任何带，但是下面很强的band 不知是什么？
不知是否是这个影响了 IP，如何消除掉这种非特异性。
还请对 SUMO 有经验的大小牛们不吝赐教。多谢 |
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M********r
发帖数: 142 | 47 那就是DNA提纯失败了。
直接用Qiagen的PCR purification kit就行。
带着beads一起解交联，然后当作普通的PCR产物纯化的步骤。beads堆在column里面没
事的，不影响 |
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x*********n
发帖数: 43 | 48 苦逼做植物的，想看看一个蛋白在某种处理后有没有磷酸化修饰。现在已经有挂了标签
的我的蛋白的转基因植株。初步是想用标签IP下来用磷酸化的抗体来做WB，可是听说常
用的4G10抗体对植物蛋白不怎么好用？有没有谁能推荐一个针对植物蛋白好用的呀？
其实更像用磷酸化的beads把总蛋白里磷酸化了的蛋白拉下来，然后用我的蛋白上的特
异性的标签来做WB，感觉更有说服力。可是没找到这种beads。。。谁有信息的话能否
提供一下呢
谢谢啊 |
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x*********a
发帖数: 24 | 49 一直在尝试做Hsp90 IP的实验，一直失败ing。
我把我做的实验条件贴出来，感觉版上的人都很热心，希望大家能指点迷津，多谢了。
裂解细胞，我一开始用的是invitrogen的M-PER buffer,后来看文献改成了NP-40的
buffer， NP-40的浓度时1%。
immunoprecipitation用的是life technology的kit，Dynabeads ProteinG， magnetic
beads。Hsp90的抗体用的是anti mouse的单抗 IgG2a.
我先将lysate跟antibody Hsp90（100:1） 混合，4度摇一个小时，然后加beads
incubate overnight。第二天wash 三次，然后用kit 里面的elution buffer加loading
dye 90度10min中，然后跑胶做western。
wash buffer本来用的是PBS，后来改成了cell signaling 买的kinase buffer， 里面
含 25 mM Tris-HCl, 5 mM glycerophosphate, 2 mM DTT,... 阅读全帖 |
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n***w
发帖数: 2405 | 50 But the protocol is first to bind antibody to the beads and then bind your
antigen. What you described here is you mixed antigen and antibody first and
then added beads. |
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