f*****9
发帖数: 6768 | 1 扯几把蛋，挖坑。这个Addgene的 protocol都是大半年以前的事了，就是韩在继续糊弄
大家，有个屁的秘密。在他这个东西公开后，别人照样不能重复 |
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J**********u
发帖数: 71 | 2 在准备job talk的slides，要给系里面的老师及研究生一个seminar
Question 1
其中一部分内容我自己发了两篇文章，之后实验室在我工作的基础上又发了四篇文章(
都没有带我的名字)，都在行业一流的杂志。其中三篇是我原来方法的复制，只有一篇
有一些创新。可否在这一部分job talk上加一个slide讲自己工作的impact，提及这些
后续工作。构建的试验材料也已经放在了一个非营利机构上(addgene)，其他人可以免
费access。
Question 2
job talk 第二部分内容被美国以及欧洲一些研究组用在了其他系统上，法国以及英国
的组也根据我的试验结果进行了仿真模拟。可否提及这一部分内容？
这样做会不会遭到 search committee反感，给人留下不够谦虚地感觉？
谢谢！ |
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A******y
发帖数: 2041 | 4 Recombinant protein is around 300 a pop...if you need a lot of protein, you
need to make it yourself. Also, does activity matter? If you are doing
structure, making protein should be a piece of cake or you are in the wrong
lab. Or you can call the company for a larger scale quote. I used BPS biosciences, and the owner will do his best to make a sell and will try to make thing works, but I bet it will still cost you.
or try addgene and hope the plasmid of interest is deposited and make it
you |
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g*********r
发帖数: 59 | 5 Glad to hear that. I thought I might make some mistakes during midi prep.
I also notice that sequence provided by addgene is not right. I tried to cut
it with kpni.the bands I got differs from predict. |
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x*****e
发帖数: 309 | 6 我最近也在查，有个朋友给我推荐www.addgene.org ms 不错 |
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o**i
发帖数: 1165 | 7 plasmid addgene挺好
cell coriell也可 |
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j********r
发帖数: 156 | 8 多谢帮助！巧的是我最初从addgene买的两个质粒其中一个就是pCAG2LMKOSimO。在293T
中满眼的红色，在primary MEF中啥荧光都没有。请问你G418拿到的克隆显微镜下有荧
光吗？原来primary MEF也能长十几天，我也来试试。Thanks a lot, |
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J********3
发帖数: 3151 | 9 我们也是从addgene买的，因为没认真做这个，就是大概齐建立个方法以备将来用，还
真没观测过荧光，不过293T跟MEF表达水平差太远，肉眼几乎看不见荧光也正常，俺以
前用U2OS做GFP-tag的稳定细胞株，初期能看见很绿，到挑克隆时也基本看不清了，但
用FACS能sort。俺的primary MEF是3/48的iPS，比永生MEF少几倍，俺们lab另一个人是
0/96，俺也不大清楚他为啥就不灵。
实在不行，可以把培养基里加点GSK-3 inhibitor，俺加了2i，90%以上的胚ICM能诱导
出ES来，不加的话，也就30-50%的胚ICM能诱导出ES来，这个不是简单的两三倍差别，
应该是非常大的差别。
293T |
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b******r
发帖数: 111 | 10 Anyone has experience of inserting 9kb in a 8.4kb vector? 2 months was gone
,but I get nothing. Would
you like to take a look a this protocol and give me some suggestion ?
Thanks a lot
Purpose: Insert 9kb mouse sequence into vector pPNT6.
Vector pPNT6: Its map is at http://www.addgene.org/pgvec1?
f=c&identifier=11072&atqx=pnt6&cmd=findpl . I have inserted 0.9kb DNA in
this vector at XhoI/EcorI
double sites. I should have no problem in cloning short fragment.
Insert DNA is 9kb.I have cloned t... 阅读全帖 |
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p******i
发帖数: 1092 | 11 我现在在台湾，这里貌似没有addgene的代理……不知道海关如何……因为是邮寄细菌
的管子……
现在还在找其他家有没有卖…… |
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p******i
发帖数: 1092 | 12 我猜在related products里面吧……
你去addgene买个3XFLAG的CMV promoter的plasmid，最好蛋白size也和你做的差不多，
自己做transfection…… |
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p****z
发帖数: 31 | 13 最近想用retrovirus转一个基因,用的是pBabe-hygro,addgene protocol上推荐的细胞
系我们没有，隔壁实验市用的是Phoniex A,不知道这个细胞系可以用来转pBabe-based
vector 吗？老板最近经费不多，不想让费钱在一个可能只用几次的细胞系上。谢谢！ |
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W****C
发帖数: 1937 | 16 我估计你是要ｐｒｏｍｏｔｅｒ上有ｓｔａｔ３ ｃｏｎｃｅｎｓｕｓ ｂｉｎｄｉｎ
ｇ ｓｉｔｅｓ的质粒， addgene里没查到， 我只有ｍｉｒ２１的， 文献上说有
一个ｓｔａｔ３ ｓｉｔｅ |
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b**********8
发帖数: 349 | 17 如题，手上的一个真和表达质粒，据说是当初从Addgene买回来的，DH5alpha的菌液，
前段时间快用完了，用TOP10做了转化，使用invitrogen的midi prep kit提取中抽，产
量超低，几乎看不到沉淀，重复两次都一样，同一批操作的其它质粒都没问题，产量一
般在100ug左右。后来考虑是不是感受态不同导致，找别的组要了DH5alpha回来转化，
再提，还是没有改善，只能看到很少的一点点白色沉淀，现在正在airdry，估计产量也
就在几ug的水平，请问大家有没有遇到这个问题，该怎么解决呢？ |
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w******n
发帖数: 767 | 18 买过一个addgene的质粒，小提提不出来，大提才行。 |
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z*t
发帖数: 863 | 19 我只知道addgene有个lentiviral tet-on/off的可以这么干，但是没有gateway,不过你
不急的话可以自己把attL从donor vector上PCR下来然后装在这个leniviral载体上 |
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j**W
发帖数: 89 | 20 这个addgene的lentiviral tet-on/off可以同时放shRNA和cDNA?有link吗?attL同时要
放在两个地方，怎么弄呢？ |
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T*****n
发帖数: 274 | 22 简单啊，克隆进去不就行了。在那段丢失序列附近找特异性酶切位点，PCR克隆。
不想做酶切连接的话overlapping PCR应该也行，视质粒大小。 |
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x**w
发帖数: 112 | 23 我买过一次，酶切以后发现大小有问题，还没送去sequencing他们写email来说plasmid
搞错了，然后说以后可以免费订一个做补偿。。。。 |
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g*****n
发帖数: 241 | 24 我们实验室从addgene买了一个plasmid，是Spectinomycin resistance (pDONR322
backbone),但我们实验室没有Spectinomycin，请问有没有其它兼容的抗生素，比如Amp
, Kan, Tet, Chl等等？
谢谢 |
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k*****s
发帖数: 36 | 25 Thanks!
How about other bacterias?
I tried addgene but no luck. |
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l***y
发帖数: 638 | 29 search IMAGE clones, then order from ATCC, Thermo/Fisher, Invitrogen |
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a****l
发帖数: 125 | 31 Origene
ATCC
Invitrogen
Open Biosystems |
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V***b
发帖数: 3419 | 32 谢谢楼上的各位。我这个基因研究的人很稀少，但还是找到了。 |
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V***b
发帖数: 3419 | 33 $1400买个基因是不是多了点儿？虽然老板很少过问花钱。不过这个买来就能用。便宜
的也有，但自己还得弄，装个tag，换个质粒什么的。 |
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D***y
发帖数: 693 | 36 addgene有个lentivirus based载体：FUW-SOKM ，是Rudolf Jaenisch实验室的。 |
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m*****z
发帖数: 1451 | 37 check addgene
pTETO-FUW-OSKM
Did you mean this? |
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B******o
发帖数: 496 | 39 pLKO.1本身就是lentiviral vector. 你用它在293细胞内生产lentivirus。然后用
virus直接infect你的目标细胞。感染后，vector大概需要2-3天开始表达你的shRNA，
你再等个2-3天就可以看knockdown的效率了。生产virus的时候你需要co-transfect
virus packaging vector。 SBI的那套效率不错。Addgene上也有类似的，具体的条件
得自己摸一下。
pLKO如果只是做transfection的时候KD效率不咋的。但用virus去KD基因的话，5个
shRNA至少有2个都能超过70%。
infect过的细胞因为virus是整合在基因组上的，可以养很长时间，即使不加药筛
选。 |
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f*******a
发帖数: 671 | 41 不好意思我是克隆白痴。这个vector上面是不是没有PGK promoter? 否则为什么只标注
PGK primer?为什么要这么设计？
直接用这个vector能表达Cre吗？谢谢！
链接如下。
http://www.addgene.org/20781/ |
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s**********a
发帖数: 92 | 42 #1是从 addgene 买的，#2 是从 CLEVERS lab 来的。 |
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h******t
发帖数: 56 | 43 我先用的是pEN-TmiRC3 entry vector和pslik-Neo 目的质粒，效率非常低。
后来试用了pWPI vector, 在addgene就有，效率就非常高了，但是pWPI vector是第二
代 lentivirus vector,我就没有继续使用了。所以我也不能完全确定的说是因为LR
reaction造成了问题还是因为第二代lentivirus因为有更多的HIV gene,所以效率更高
。希望你的试验能给个更conclusive的答案。 |
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h******t
发帖数: 56 | 44 我觉得不是每次gateway都不work,但是gateway可能对某种sequence特别敏感，导致出
现问题。
我用过的就这些了，但是我搜了一下，addgene上还是有很多没有GFP，不是gateway的
lentivirus vector的，不知道pLKO.1怎么样 |
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y*****w
发帖数: 146 | 46 实验课题需要用到Yeast GAL1和GAL10 promoters.在addgene 上查到了GAL1 promoter
sequence， 但是怎么google都查不到GAL10 promoter sequence。有谁知道Yeast
GAL10 promoter sequence? 请发邮件至y******[email protected] 十分谢谢! |
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c*******n
发帖数: 27 | 47 Order it from:
www.addgene.org/1106/
Less than $100.
行。 |
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c**i
发帖数: 265 | 48 原来买基因都是到addgene和MGC，这两个查了，都没有。 UVR8，就是施一公组2月做出
来的那个。有没有人知道那里能买到？谢谢了。 |
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w*e
发帖数: 740 | 50 有正在建2A系统的的么？
我想确认一下我的T2A,P2A的DNA序列是否正确，
网上文章的，还有addgene上的序列都不大一样
谢谢 |
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