c********n
发帖数: 225 | 1 第四类“重复” 验证实验信息：实名, 网络、论坛发布
- 重复、拓展验证实验不能支持NgAgo基因组编辑功能
暂只收录包含有具体实验信息（eg. 实验材料，步骤，etc）的发布报告
第二则
- 发布方：James Gagnon
- 发布时间：2016年7月8日至2016年7月29日
- 发布平台：google groups, twitter
- 发布方国家：美国
- 发布方城市：Cambridge, MA
- 发布方研究机构：Harvard University
- 实验室PI：Dr. Alex Schier
- NgAgo的来源：Addgene
o cloned into pCS2 vector for mRNA transcription, for use in zebrafish
- 应用验证实验结果:
o MiSeq PCR Amplicon高通量测序作为检测手段
o Twitter post “And no indels after amplicon MiSeq of NgAgo injected
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发帖数: 225 | 3 第五类“重复” 验证实验信息：无记名， 网络、论坛发布
- 重复、拓展验证实验不能支持NgAgo基因组编辑功能
- 暂只收录包含有具体实验信息（eg实验材料，步骤，总结etc）的发
布报告
- 以无记名或发布方具体信息不全的形式发表
- 需包含发布时间 （或注明2018年8月8日之前或之后）
- 建议包含发布方城市、国家信息
- 建议注明是否应用2016年8月8日韩春雨组在Addgene更新的Protocol的相关条件
共计三则
- 发布方：未知
- 发布时间：2016年10月6日
- 发布平台：澎湃新闻
- 发布方国家：中国
- 发布方城市：未知
- 发布方研究机构：未知
- 实验室PI：未知
- NgAgo的来源：韩春雨实验室或其他渠道，比如，通过基因合成
- 重复验证实验结果:重复、拓展验证实验不能支持NgAgo基因组编辑功能
- 重复验证实验详细信息：
根据新闻报导，三个实验室都进行了多次重复实验 （见原文报道）
- 实验数据发表状态：无
- 实验数据发表的科研杂志：无
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发帖数: 225 | 4 第四类“重复” 验证实验信息：实名, 网络、论坛发布
- 重复、拓展验证实验不能支持NgAgo基因组编辑功能
暂只收录包含有具体实验信息（eg实验材料，步骤，etc）的发布报告
第一则
- 发布方：Dr. Davide Seruggia
- 发布时间：2016年6月23日 至2016年7月20日
- 发布平台：google groups
- 发布方国家：美国
- 发布方城市：Boston
- 发布方研究机构：Boston Children's Hospital
- 实验室PI：Dr. Davide Seruggia
- NgAgo的来源：Addgene
- 重复及验证实验结果:
o 重复文章中的NgAgo/gDNA - GFP实验不成功 （对比实验Cas9 –“dramatic
reduction”）
o 拓展实验inject embryos - ”pups with no phenotype, no indels”
- 重复及验证详细信息: oligo来源及用量，实验简介，实验结果简汇
- 实验数据发... 阅读全帖 |
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发帖数: 225 | 5 第四类“重复” 验证实验信息：实名, 网络、论坛发布
- 重复、拓展验证实验不能支持NgAgo基因组编辑功能
暂只收录包含有具体实验信息（eg. 实验材料，步骤，etc）的发布报告
第二则
- 发布方：James Gagnon
- 发布时间：2016年7月8日至2016年7月29日
- 发布平台：google groups, twitter
- 发布方国家：美国
- 发布方城市：Cambridge, MA
- 发布方研究机构：Harvard University
- 实验室PI：Dr. Alex Schier
- NgAgo的来源：Addgene
o cloned into pCS2 vector for mRNA transcription, for use in zebrafish
- 应用验证实验结果:
o MiSeq PCR Amplicon高通量测序作为检测手段
o Twitter post “And no indels after amplicon MiSeq of NgAgo injected
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发帖数: 225 | 7 第五类“重复” 验证实验信息：无记名， 网络、论坛发布
- 重复、拓展验证实验不能支持NgAgo基因组编辑功能
- 暂只收录包含有具体实验信息（eg实验材料，步骤，总结etc）的发
布报告
- 以无记名或发布方具体信息不全的形式发表
- 需包含发布时间 （或注明2018年8月8日之前或之后）
- 建议包含发布方城市、国家信息
- 建议注明是否应用2016年8月8日韩春雨组在Addgene更新的Protocol的相关条件
共计三则
- 发布方：未知
- 发布时间：2016年10月6日
- 发布平台：澎湃新闻
- 发布方国家：中国
- 发布方城市：未知
- 发布方研究机构：未知
- 实验室PI：未知
- NgAgo的来源：韩春雨实验室或其他渠道，比如，通过基因合成
- 重复验证实验结果:重复、拓展验证实验不能支持NgAgo基因组编辑功能
- 重复验证实验详细信息：
根据新闻报导，三个实验室都进行了多次重复实验 （见原文报道）
- 实验数据发表状态：无
- 实验数据发表的科研杂志：无
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发帖数: 225 | 8 实例记录 - 首例 第三类信息
第三类“重复” 验证实验信息：实名，科研杂志发布
− 在科研杂志上实名发表的关于重复、验证NgAgo基因组编辑功能的文
章
− 需有具体实验设计流程描述，实验材料来源信息，实验数据及分析
− 需有citation link
- 需包含发布时间
- 需注明是否应用2016年8月8日韩春雨组在Addgene更新的Protocol的相关条件
信息简述：
- 发布方：Jialing Qi et al
- 发布时间：2016年11月11日
- 发布平台：Cell Research
- 发布方国家：中国
- 发布方城市：江苏南通
- 发布方研究机构：Co-innovation Center of Neuroregeneration, Jiangsu Key
Laboratory of Neuroregeneration, Nantong University
- 实验室PI：Dong Liu
- NgAgo的来源：Synthetic codon opti... 阅读全帖 |
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发帖数: 225 | 9 实例记录 - 第三类信息， 第二例
第三类“重复” 验证实验信息：实名，科研杂志发布
− 在科研杂志上实名发表的关于重复、验证NgAgo基因组编辑功能的文
章
− 需有具体实验设计流程描述，实验材料来源信息，实验数据及分析
− 需有citation link
- 需包含发布时间
- 需注明是否应用2016年8月8日韩春雨组在Addgene更新的Protocol的相关条件
信息简述：
- 发布方：Burgess， Cheng， et al
- 发布时间：2016年11月15日
- 发布平台：Protein & Cell
- 发布方国家：二十家中外实验室， 18所科研院校
- 发布方城市：美国及中国
- 发布方研究机构：
1.National Human Genome Research Institute, NIHBethesdaUSA
2.Division of Hematology in Department of MedicineJohns Hopkins University
S... 阅读全帖 |
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发帖数: 225 | 10 实例记录 - 第三类信息， 第三例
第三类“重复” 验证实验信息：实名，科研杂志发布
− 在科研杂志上实名发表的关于重复、验证NgAgo基因组编辑功能的文
章
− 需有具体实验设计流程描述，实验材料来源信息，实验数据及分析
− 需有citation link
- 需包含发布时间
- 需注明是否应用2016年8月8日韩春雨组在Addgene更新的Protocol的相关条件
信息简述：
- 发布方：SH Lee et al
- 发布时间：2016年11月28日
- 发布平台：Nature Biotechnology
- 发布方国家：韩国，德国，美国
- 发布方城市：见文章
- 发布方研究机构：
-Center for Genome Engineering, Institute for Basic Science (IBS), Seoul,
South Korea.
-Institute for Cell and Gene Therapy, Medical Center—Universit... 阅读全帖 |
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发帖数: 225 | 11 实例记录 - 第三类信息， 第四例
第三类“重复” 验证实验信息：实名，科研杂志发布
− 在科研杂志上实名发表的关于重复、验证NgAgo基因组编辑功能的文
章
− 需有具体实验设计流程描述，实验材料来源信息，实验数据及分析
− 需有citation link
- 需包含发布时间
- 需注明是否应用2016年8月8日韩春雨组在Addgene更新的Protocol的相关条件
信息简述：
- 发布方：Nay Chi Khin, Jenna Louise Lowe, Jensen M Lora, Gaetan Burgio
- 发布时间：2016年12月6日
- 发布平台：bioRxiv
- 发布方国家：澳大利亚
- 发布方城市：见文章
- 发布方研究机构：
John Curtin School of Medical Research, the Australian National University
- 实验室PI：Dr Gaetan Burgio
- NgAgo的来源：... 阅读全帖 |
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发帖数: 225 | 12 实例记录 - 首例 第三类信息
第三类“重复” 验证实验信息：实名，科研杂志发布
− 在科研杂志上实名发表的关于重复、验证NgAgo基因组编辑功能的文
章
− 需有具体实验设计流程描述，实验材料来源信息，实验数据及分析
− 需有citation link
- 需包含发布时间
- 需注明是否应用2016年8月8日韩春雨组在Addgene更新的Protocol的相关条件
信息简述：
- 发布方：Jialing Qi et al
- 发布时间：2016年11月11日
- 发布平台：Cell Research
- 发布方国家：中国
- 发布方城市：江苏南通
- 发布方研究机构：Co-innovation Center of Neuroregeneration, Jiangsu Key
Laboratory of Neuroregeneration, Nantong University
- 实验室PI：Dong Liu
- NgAgo的来源：Synthetic codon opti... 阅读全帖 |
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发帖数: 225 | 13 实例记录 - 第三类信息， 第二例
第三类“重复” 验证实验信息：实名，科研杂志发布
− 在科研杂志上实名发表的关于重复、验证NgAgo基因组编辑功能的文
章
− 需有具体实验设计流程描述，实验材料来源信息，实验数据及分析
− 需有citation link
- 需包含发布时间
- 需注明是否应用2016年8月8日韩春雨组在Addgene更新的Protocol的相关条件
信息简述：
- 发布方：Burgess， Cheng， et al
- 发布时间：2016年11月15日
- 发布平台：Protein & Cell
- 发布方国家：二十家中外实验室， 18所科研院校
- 发布方城市：美国及中国
- 发布方研究机构：
1.National Human Genome Research Institute, NIHBethesdaUSA
2.Division of Hematology in Department of MedicineJohns Hopkins University
S... 阅读全帖 |
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发帖数: 225 | 14 实例记录 - 第三类信息， 第三例
第三类“重复” 验证实验信息：实名，科研杂志发布
− 在科研杂志上实名发表的关于重复、验证NgAgo基因组编辑功能的文
章
− 需有具体实验设计流程描述，实验材料来源信息，实验数据及分析
− 需有citation link
- 需包含发布时间
- 需注明是否应用2016年8月8日韩春雨组在Addgene更新的Protocol的相关条件
信息简述：
- 发布方：SH Lee et al
- 发布时间：2016年11月28日
- 发布平台：Nature Biotechnology
- 发布方国家：韩国，德国，美国
- 发布方城市：见文章
- 发布方研究机构：
-Center for Genome Engineering, Institute for Basic Science (IBS), Seoul,
South Korea.
-Institute for Cell and Gene Therapy, Medical Center—Universit... 阅读全帖 |
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c********n
发帖数: 225 | 15 实例记录 - 第三类信息， 第四例
第三类“重复” 验证实验信息：实名，科研杂志发布
− 在科研杂志上实名发表的关于重复、验证NgAgo基因组编辑功能的文
章
− 需有具体实验设计流程描述，实验材料来源信息，实验数据及分析
− 需有citation link
- 需包含发布时间
- 需注明是否应用2016年8月8日韩春雨组在Addgene更新的Protocol的相关条件
信息简述：
- 发布方：Nay Chi Khin, Jenna Louise Lowe, Jensen M Lora, Gaetan Burgio
- 发布时间：2016年12月6日
- 发布平台：bioRxiv
- 发布方国家：澳大利亚
- 发布方城市：见文章
- 发布方研究机构：
John Curtin School of Medical Research, the Australian National University
- 实验室PI：Dr Gaetan Burgio
- NgAgo的来源：... 阅读全帖 |
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m****a
发帖数: 270 | 20 其他部分大同小异，贴一下关键的note部分
Note:
1. NgAgo/gDNA system is extremely sensitive to contamination of
intracellularbacteria (including mycoplasma) which are widespread
and leave no visible signs of presence. Carefully excluding the
presence of intracellular bacteria before performing experiments.
2. Because Agos need magnesium, avoid EDTA when detaching and seeding cells
into the plates for transfection. Alternatively, supplementing Mg 2+ to 5 mM
(may need optimization to your cell type).
3. Avoid using L... 阅读全帖 |
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s*********y
发帖数: 292 | 21 嗯，让大家去配个没有EDTA的trypsin去试试
说实话，我不觉得这跟做不做的出来有啥关系…… |
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m****a
发帖数: 270 | 22 EDTA 是不透膜的，透膜的是EDTA-AM, 残存的那点EDTA早就被DMEM里的钙，镁给中和
掉了。
韩的protocal 转染之前还有一次换液，还剩多少EDTA在里面？ |
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n**********g
发帖数: 196 | 23 DMEM里calcium几个mM，韩老师怎么想的呢 |
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m****a
发帖数: 270 | 24 常用的 0.25% Trypsin with 1 mM EDTA
DMEM里含 2.4mM CaCl2, 0.8mM MgSO4, 干掉残存的那一丁点EDTA绰绰有余。
莫非alternatively那句话暗藏玄机？做不出来的赶紧去给培养基加点儿Mg试试。。。 |
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发帖数: 1 | 25 不要浪费别人的时间了，假货就收场了吧？
韩春雨/沈啸又不是第一个骗子，别以为这些伎俩就可以混过去。 |
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F****8
发帖数: 289 | 26 这个 protocol 和 gluestic 六月28号发的三个tricks 中的两个能对得上。
看来 gluestic 和春雨有很近的联系。
下面是他当时的帖子：
Single stranded DNA is much more difficult compared to double-stranded
plasmid DNA in terms of transformation.
Try these single stranded DNA transformation tricks.
1) transformation done at a low pH of ~6. Low pH significantly reduces the
nuclease activity of cutting single stranded DNA.
2) increase Mg++ to 1 mM. Mg is a conformation stabilizer of DNA and RNA.
3) No EDTA in the transformation system because it de... 阅读全帖 |
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l********8
发帖数: 45 | 27 是不是大家都要重新根据新的protocol再做呢？ |
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发帖数: 1 | 28 做过实验室已经发布结果了。不出意料，就是重复不了。
小保方2.0版本已经正式成立。 |
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x****6
发帖数: 4339 | 30 来自韩在addgene提供的protocol
*Since NgAgo follows “one-guide faithful” rule, i.e. guides can only be
loaded when NgAgo protein is in the process of expression, to improve the
efficiency of gDNA loading to NgAgo, sometimes multiple transfection of gDNA
helps
"guides can only be loaded when NgAgo protein is in the process of
expression",如果真是这样，这个蛋白也是蛮奇葩的。 |
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m****a
发帖数: 270 | 31 直接黏贴一下韩春雨在百度贴吧上的发言，目前已经被他删除
韩春雨滴技术，还木有实验室能重复出来。上个月北京香山会议，几位大牛想与韩共同
讨论，韩说有其他事，拂袖而去。
槐北路： 我就是本人，香山会一帮crispr cas的“友善”，我心领了。不过实验的重
复性，不是几个人说了算的，相关质粒addgen上我提交了，协和我发放了，我对自己的
东西有信心，谢谢关心啊。 6-28 09:53
其中“友善”两字有知乎网友指出这是百度贴吧的黑话，意思就是傻X。 |
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i**k
发帖数: 3 | 32 让没让别人进实验室参观不知道，至少从addgene上买的质粒，按着protocol做，很好
使啊。。。
这应该对于方法学的贡献来说，足够了。 |
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c********n
发帖数: 225 | 33 【记录历史】NgAgo'2016 - Milestones draft 第一阶段时间点补充：
（added on 2016年8月30日）
由于这则信息和以后第二阶段里的Addgene updated protocol有些相似之处
为了承前启后，也一并收入 第一阶段的milestones
Date：2016年06月28日
(NBT paper 上线近两个月以后）
(方舟子第二篇文章发表两天之前）
Title：please transfer to Biology. RE:Ng-Ago 重复
（发布于WaterWorld版）
Link:
http://www.mitbbs.com/article_t/WaterWorld/2680181.html
Key Points：
1. 提到3个关于optimize ss DNA “transformation tricks"
“Try these single stranded DNA transformation tricks.
1) transformation done at a low pH of ~6. Low pH significant... 阅读全帖 |
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c********n
发帖数: 225 | 34 实验流程第一步：
1. Cell culture
更新前
293T cells are maintained in high-glucose DMEM (HyClone) supplemented with
10% FBS (HyClone) and penicillin/streptomycin at 37°C with 5% CO2
incubation. Cells are seeded to 24-well plate (Costar) with 60% confluence 8
hours before transfection. Thirty minutes before
transfection, cells are washed twice with PBS and medium is changed to high-
glucose DMEM medium containing 2% FBS.
更新后
293T cells are maintained in high-glucose DMEM (Gibco) supplemented with 10%
FBS (Gi... 阅读全帖 |
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c********n
发帖数: 225 | 35 实验流程第二步：
2. Transfection
更新前
2-1 NLS-NgAgo expressing plasmid is extracted with Wizard® Plus SV
Minipreps DNA Purification System (Promega), and is adjusted to 100 ng/μl
in 0.5x TE buffer (5 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA，pH 8.0).
2-2 5’-phosphorylated ssDNA guides are dissolved to 100 ng/μl in 0.5x TE
buffer (PH 8.0). For each well of a 24-well plate, 200-250 ng NLS-NgAgo
plasmid and 100-300 ng guidesare diluted in 50 μl Opti-MEM (Gibco); 1.25 μ
l lipofectamine 2000 is diluted in 50 μl Opti-MEM.... 阅读全帖 |
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c********n
发帖数: 225 | 36 实验流程第三步：
3.Genomic DNA extraction
更新前
3-1 48-60 hours after transfection, cells are harvested by trypsin digestion
. Four wells of cells are combined into a 1.5 ml EP tube.
3-2 For genomic DNA extraction, 500 μl of cell lysate buffer (50 mM Tris，
100 mM EDTA，0.5% SDS，pH 8) and 10 μl proteinase K (10 mg/ml）are added
into each tube and mixed gently and sufficiently. Bathe the tubes at 55℃
for 2 hours.
3-3 200 μl Tris-Phenol and 200 ul trichloromethane are added into each tube
and mixed gently and ... 阅读全帖 |
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D********d
发帖数: 2154 | 37 累不累？
目前还有35%左右的实验室在锲而不舍的完成韩主席的任务 |
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c********n
发帖数: 225 | 38 更新后的Note部分：
（NBT 原文里没有）
Note:
1.NgAgo/gDNA system is extremely sensitive to contamination of intracellular
bacteria (including mycoplasma) which are widespread and leave no visible
signs of presence. Carefully excluding the presence of intracellular
bacteria before performing experiments.
编者注：不能有细菌污染
2.Because Agos need magnesium, avoid EDTA when detaching and seeding cells
into the plates for transfection. Alternatively, supplementing Mg2+ to 5 mM
(may need optimization to your cell type).
编者注... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 39 骗子的骗术是无穷无尽的，因为不必通过同行评议。 |
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c********n
发帖数: 225 | 40 问题总结
1.实验材料来源（Hyclone vs Gibco的培养基，以及原文没有特别提到的“Biolab”T4
PNK）会影响可重复性吗？
HyClone以及其他 T4 PNK 供应商，你们是不是要想一想自己的问题在哪里了？
还有，ThermoFisher可要注意了，你们的Lipofectamine® 3000可能有问题！
2.原文用于plasmid和guides （DNA）的0.5xTE，更新后 改成NaOH调出来的pH8.0的水。
先不谈怎么来用NaOH调出这个稳定的没有缓冲液的pH8.0的水，如果原因是由于NgAgo对
于EDTA这么的敏感，那么原文中用到的大约0.015-0.025mM的EDTA，是怎么做出的NBT文
章中的结果的？
3.关于细菌污染问题。从新闻报道和照片上看，韩春雨老师他们做实验是经常不戴手套
的，看来他们这样做细菌污染机率会减少。所以这些重复NgAgo实验的人们，你们重复
NgAgo实验的时候，带手套了吗？你们的实验材料有没有被细菌污染呢？
4.看来Mg2+的浓度，在不同的cell type也需要optimize
5.看来ss gDNA 二次转染... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 41 比较好奇Ago enzymes的active pH range是什么。 |
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m******e
发帖数: 459 | 42 如果是原创，强烈支持！希望方舟子们引用的时候记得给楼主credit |
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c********n
发帖数: 225 | 43 编者声明：
- 这里比对总结的很多点，大家在各个论坛讨论都或多或少的提到过
- 如果大家也花了时间研究以后，发现什么别的问题，都加上来吧
- 算是我们对于花了时间，精力和资金来重复或应用了NgAgo的研究人员们的一点支持吧
大家都应当欢迎全文转载，是吧？
请注明出处是 mitbbs biology 论坛 就好了
-CoinByCoin
2016年8月30日 |
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发帖数: 1 | 46 谢谢你，我其实有在mitbbs，欢迎各位将有价值的信息与我交流，我的工作邮箱：wyy@
thepaper.cn |
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发帖数: 1 | 48 加油。
韩的事件不知道以何种形式收尾。
但基本不寄托于河北科技大学以及河北省公平处理了。
期待着澎湃王记者更进一步调查。
wyy@ |
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c********n
发帖数: 225 | 49 编者注：
1.韩春雨实验室在NBT文章中发表的数据，是用更新前的实验流程做出来的。
至今为止（2016年9月1日），世界上除了韩春雨实验室，还未有任何实验室能用这个更
新前的流程，重复验证出NBT文章中NgAgo基因编辑的能力。
2. 韩春雨实验室在公布更新后的实验流程以后，至今还未公布用此流程，任何成功重
复验证的结果。也没有任何一家其他实验室，能够公布用此流程而成功重复验证的结果。
因此：
- 在没有应用韩春雨所提出的“高超的实验技巧”之前，至今，世界上只有韩春雨一家
实验室，可以做出NgAgo基因编辑的结果
- 在韩春雨提出了“高超的实验技巧”之后，至今，世界上没有任何一家实验室，包括
韩春雨实验室，能够用这些“高超的实验技巧”，做出NgAgo基因编辑的结果
转载声明
-在注明出处 （mitbbs biology 版） 之后，编者授权全文转载。
2016年9月1日
CoinByCoin |
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