c********n
发帖数: 225 | 1 【记录历史】NgAgo实验流程Addgene更新前后的比对
读好书，读好文，有益身心健康。
看文章，做记录，做总结，找原因，找规律，可以避免浪费以后的时间和精力
我们来记录一下韩春雨实验室提供的NgAgo实验流程，
在Addgene 2016年8月8日 更新前后，做一下比对
Reference：
原始发表的protocol
doi:10.1038/nbt.3547-s1, supplementary information
更新后的protocol
Addgene Han Lab added tips 2016年8月8日
https://www.addgene.org/78253/
under “RESOURCE INFORMATION” section “Supplemental Documents”
先看title
更新前
A general protocol of NgAgo/gDNA-mediated genome editing and examination (
T7E1 assay)
更新后
A general protocol of NgAgo/gDNA-mediate... 阅读全帖 |
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n********e
发帖数: 50 | 2 可问题来了。addgene会从他们卖的质粒中获利。如果addgene只管收质粒，随便卖不用
付什么责任的话，那这个生意岂不是太容易做了？就算不全是addgene的错，好歹我们
的实验证实质粒有问题，他们应该深入查查以免其他人买同样有问题的质粒浪费时间金
钱，可是他们的原则反正死活你的实验有问题，这点很让人不爽。 |
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d**********t
发帖数: 20415 | 3 addgene就是一个保管的中心，没有什么QA一说，谁submit的谁负责，addgene好歹自己
会去测个序，供买的人参考，如果让addgene保证质粒的质量，那他一个质粒估计至少
就要买500了，而不是现在的这个价格了
！！ |
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a*****v
发帖数: 128 | 4 小弟最近从Addgene上购买了几个质粒，最初觉得都是发表的文章的质粒，应该没啥问
题，就随便用Addgene的基因blast一下，发现我跟我要的target匹配就结束了。
过了两天仔细一看，居然少了20几个氨基酸，其他才是完全匹配，这帮狗日的怎么用这
样的质粒发的文章啊？
我要不要写信询问一下那个发文章的人啊？
这我买回来，岂不是还要给他们把那20几个氨基酸补上去啊？大侠们有什么简单的办法
么？ |
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V******t
发帖数: 444 | 5 从addgene要来的质粒，是寄来的穿刺培养菌。没有说明书。求问这种穿刺菌是addgene
已经培养过了，只要挑琼脂就能直接在液体LB培养，还是需要自己先把整个瓶子在37度
培养过夜，再挑穿刺线上的菌落或者琼脂划线，再挑单克隆到液体LB培养？
谢谢！ |
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n********e
发帖数: 50 | 6 这个addgene的质量控制非常差，从它那里买10个质粒有1-2个work就不错了，尤其是
library的质粒。先前买了这个Human GeCKO v2 Library (1 Plasmid System), 无论是
PCR，挑单克隆测序，或是按照文献去酶切，都不能准确得到sgRNA。而且，addgene的
客服很差，总是推脱不是他们的问题，而是我们这里的检验手段不对，真是笑话。前后
花了750刀，就算打水漂了。提醒大家买这家的质粒一定要小心了。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 7 Addgene 并不是一个公司而是一个收集机构。他们的东西都是user submit 的。
Addgene 这个组织并不保证上面的东西都是正确的。买来的东西必须要自行验证后才能
用。 |
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D******a
发帖数: 39 | 8 我们学校某些老板在seminar上建议大家把自己实验室的plasmid交给addgene。因为交
了之后addgene会测序并告诉你结果。。。你懂的。 |
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D******a
发帖数: 39 | 9 有个老板说，给addgene plasmid若干，发现大部分都有mutation，（包括insertion，
deletion）。。。然后他就知道这个plasmid为什么不work了。addgene据说照样按正常
的卖 |
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r********s
发帖数: 149 | 10 从那里买过几十个，只有一个空载体好像不对。
[在 neveralone (have fun) 的大作中提到：]
：这个addgene的质量控制非常差，从它那里买10个质粒有1-2个work就不错了，尤其是
：library的质粒。先前买了这个Human GeCKO v2 Library (1 Plasmid System), 无论
是PCR，挑单克隆测序，或是按照文献去酶切，都不能准确得到sgRNA。而且，addgene的
：........... |
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n********e
发帖数: 50 | 11 我知道他们卖的不贵， 但他们成本也低，又不用自己做质粒，只是从别人那要来的，
当然不会很贵。
其实这才是生财之道，看起来很便宜又不用负责任。以前，要质粒都是免费的，现在这
个addgene却可以以此为生，这是狡猾又聪明。
我的point是：不要全信addgene所谓的测序，重要质粒还是自己构建或找专业公司合成
，虽然花时间且贵些，但值得信赖。 |
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l***C
发帖数: 334 | 12 想办法逼addgene在网站上开comment让买了质粒的人留review，哪个好用哪个不好用让
大家都知道，这个信息addgene自己肯定知道不少就是不公开 |
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D******e
发帖数: 18 | 13 各位朋友，大家好！我在美东马里兰州，最近注册成立了一个生物公司，想做一些有关
病毒的工作。我发现Addgene正提供很多有用的质粒，对此我很感兴趣。因为我们不是
non-profit，因此不允许从Addgene购买。不知各位朋友能否给帮一个忙，买一下，我
需要大概30个左右的质粒，可以分批买！我将付双倍价钱！有意者请站内私信给我！万
分感谢! |
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D******e
发帖数: 18 | 14 本人现在注册成立了一家生物公司，不方便再从Addgene购买质粒。能否烦请论坛的朋
友帮忙从Addgene购买若干质粒。我将付双倍价钱，质粒小提后分享全部所购买质粒。
有意者请私信给我！十分感谢！ |
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l******n
发帖数: 298 | 15 请问用addgene买的质粒表达出来一个很新颖的蛋白，想卖钱的话需要跟addgene打招呼
吗？买的时候是从学校买的。现在送人了人家问到这个我也不懂。之前没接触过类似问
题。怎么能避开呢？ |
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X***n
发帖数: 366 | 16 Addgene这么便宜地交换，谁还会去Promega, Clontech买啊？反正大家大部分都是non-
profit,academic。License说不能create backbone， 切掉insert，替换成我想要的，
算不算re-create backbone? 请指点。 |
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y******y
发帖数: 3 | 17 大家好，有一个问题请教大家，如何使用addgene购买质粒，需要通过学校的MTA吗？具
体的过程是什么？谢谢！ |
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j******n
发帖数: 941 | 18 正常程序下单 然后addgene会发mta的一系列文件让你填 搞定才会发货给你 |
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e*****i
发帖数: 149 | 19 一个plasmid才65美元，是什么样的成本呢？人工不便宜，每次复苏E coli吗？多麻烦
啊。
有人知道addgene是怎样做才能让自己的成本和收入基本平衡？
我总感觉他们是亏本买卖尽管他们是NPO。 |
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A******y
发帖数: 2041 | 20 Addgene gives you a Ecoli stick. You have to re-select and culture it out.
It is on the deposit system by scientists who made the plasmids. |
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K********g
发帖数: 58 | 21 很感兴趣两个aav质粒AAV-SpCas9 and AAV-SpGuide，addgene还没有
写信给他估计他也看不到。 |
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r********s
发帖数: 149 | 22 张峰很厚道，不要等这么久，已经在addgene了。 |
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n********e
发帖数: 50 | 23 是啊，addgene就是有这样的问题；有些质粒粗测序看似正确，但是就是不表达或表达
size不对。虽然号称是非营利，但只要把质粒卖出去，那些人的工作和收入有保障啊！！
建议重要的质粒还是自己构建，虽然花时间，但品质有保障！！ |
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s******r
发帖数: 1245 | 24 还好吧，以前从addgene买过好多次，基本都能用
你这个gRNA library我们也买过，测序没问题 |
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s******y
发帖数: 28562 | 25 是啊，美国的人工费那么贵，他们一个质粒只收65美元，其实真的不贵。
而且Addgene 里收集了很多稀奇古怪的东西，公司里根本就不卖，因为那些稀奇古怪的
东西每年顶多一两个人来要，根本赚不回保管费。 |
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a*******e
发帖数: 245 | 26 You got it!
addgene 本来就是一个挂着所谓的非盈利的招牌，但确是钱挣得大把大把
另一方面它又的确提供了很多方便
为什么没有人搞一个比较好的质粒储存库呢，客户保质保量，还可以给提交质粒的人分
成，岂不更好
65刀的无保证质粒，和150刀的高质量质粒，很多人应该更倾向于150刀的吧 |
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s******y
发帖数: 28562 | 27
你小看了众人的贪小便宜的本质了。
其实公司里面的质粒最便宜的才200多。但是一堆人为了省钱而跑去找addgene |
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n********e
发帖数: 50 | 28 这是个好主意。只是怎样才能“逼”addgene开通comment呢？ |
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c********n
发帖数: 225 | 32 第四类“重复” 验证实验信息：实名, 网络、论坛发布
- 重复、拓展验证实验不能支持NgAgo基因组编辑功能
- 包含有具体实验信息（eg实验材料，步骤，etc）以及发布方具体信
息的发布报告
- 需包含发布时间
- 建议注明是否应用2016年8月8日韩春雨组在Addgene更新的Protocol的相关条件
信息简述：
- 发布方：Dr Gaetan Burgio*
- 发布时间：2016年8月26日
- 发布平台：twitter，medium.com
- 发布方国家：澳洲 Australia
- 发布方城市：Canberra
- 发布方研究机构：JCSMR，ANU College of Medicine, Biology and Environment
- 实验室PI：Dr Gaetan Burgio
- NgAgo的来源：Addgene
- 应用验证实验结果: 无法验证韩春雨NgAgo基因编辑的实验结果
作者特别声明
1.是在“mouse zygote”系统应用的NgAgo，是作者实验室非常熟悉的系统，无... 阅读全帖 |
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c********n
发帖数: 225 | 33 第四类“重复” 验证实验信息：实名, 网络、论坛发布
- 重复、拓展验证实验不能支持NgAgo基因组编辑功能
- 包含有具体实验信息（eg实验材料，步骤，etc）以及发布方具体信
息的发布报告
- 需包含发布时间
- 建议注明是否应用2016年8月8日韩春雨组在Addgene更新的Protocol的相关条件
信息简述：
- 发布方：Dr Gaetan Burgio*
- 发布时间：2016年8月26日
- 发布平台：twitter，medium.com
- 发布方国家：澳洲 Australia
- 发布方城市：Canberra
- 发布方研究机构：JCSMR，ANU College of Medicine, Biology and Environment
- 实验室PI：Dr Gaetan Burgio
- NgAgo的来源：Addgene
- 应用验证实验结果: 无法验证韩春雨NgAgo基因编辑的实验结果
作者特别声明
1.是在“mouse zygote”系统应用的NgAgo，是作者实验室非常熟悉的系统，无... 阅读全帖 |
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i***s
发帖数: 39120 | 34 韩春雨实验室所在的四层老楼新安装上智能门。
韩春雨论文中的关键实验环节。
韩春雨瘦了，一位接近他的人说，最近韩春雨经常做实验到凌晨两三点钟。
他的实验室在河北科技大学一座四层老楼里，红色的外墙伏满了爬墙虎，韩春雨在这一待就是10年。今年5月2日，一篇关于新基因编辑技术NgAgo的论文在国际顶级期刊《自然·生物技术》（Nature Biotechnology）在线发表（后在该刊第34册7月号纸质版发表），作者是河北科技大学副教授韩春雨领衔的课题组。发表后，不仅他个人，连他所在的实验室，都获得了前所未有的关注。为了安全，学校不得不给实验楼安装上刷卡入内的智能门，还布了摄像头。
韩春雨有两间研究室在三楼走廊的尽头。在接待过一波又一波记者，甚至有长江学者来访的房间里，一张白色纸片嵌在插座缝里，上面写着“Arrival of the Argonautes 1.0T and 2.0 Smart! （Ago1.0T和2.0Smart版本的到来！）”，后缀为两个笑脸。实验室在等NgAgo优化版2.0尽快问世。
但NgAgo1.0仍然摇摇欲坠。由于多个实验室无法重复实验，被认为可以超越时兴的CRISPR... 阅读全帖 |
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c********n
发帖数: 225 | 37 【记录历史】NgAgo'2016 - Milestones draft 第一阶段时间点补充：
（added on 2016年8月28日）
NgAgo 序列，其基因编辑功能信息，以及相关实验流程， 对大众公开的几个时间点的
补充
Date：2016年04月13日（在NBT paper 上线前约2个多星期）
Title：以Argonaute核酸酶为核心的基因编辑技术 （中国专利号CN 105483118 A）
Links:
https://www.google.com/patents/CN105483118A
https://www.google.com/patents/CN105483118A?cl=zh
Key Points：
- 沈啸、韩春雨 （浙江大学）Ago基因编辑专利发表
- 特别注明：
1. 专利filing date：Dec 21, 2015
2. 根据专利描述，不但NgAgo有基因编辑功能，HpAgo、NaAgo和NtAgo “都与NgAgo一
样有很强的编辑哺乳动物细胞内基因表达的能力”；以及MaAgo，NpAgo，NIESAgo，
SchAgo，SPAgo “等Arg... 阅读全帖 |
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c********n
发帖数: 225 | 38 【记录历史】NgAgo’2016 – 第一阶段Milestones 修订版
我们生活在一个奇妙的时代。
在这个时代，由于生物技术的进步，我们的生老病死，我们的衣食住行， 都
在不断地经受着各种微妙的，或是革新性的变化所带来的压力。
我们的思维方式，我们的行为准则，我们的道德底线，也在不停地被考验着。
到了2016年，CRISPR/Cas9基因编辑技术，已经日渐成熟。任何生命体，包括
我们赖以繁衍的生殖细胞，我们的DNA，都有可能很容易被修改。基因编辑技
术的应用，也成为了各种投资的宠儿。
而在2016年夏天，中国河北科技大学的韩春雨实验室，在Nature
Biotechnology（NBT）杂志上，发表了一篇论文，宣布了一个“新的、高效
的基因编辑技术 – NgAgo/gDNA”的诞生。
这篇文章，引起了世界各地业界同行的广泛重视，大规模重复验证NgAgo基因
编辑功能的各种信息，在网络上不断地更新着。
三个多月了，无法重复验证NgAgo的数据不断地出现，至今为止，还没有人能
够发布任何正式的，可重复实验结果。
研究人员们越来越困惑，也越来越担心，韩春雨和他的同事们在NBT发表的
Ng... 阅读全帖 |
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c********n
发帖数: 225 | 40 鉴于在韩春雨实验室2016年8月8日于Addgene更新了实验流程 （Note-1）之后，
已有具有可靠科研训练基础及科研诚信度的研究人员们，在2016年8月8日之前重复验证
NgAgo基因组编辑功能失败之后，宣布基于韩春雨实验室更新发布的试验流程，开始重
新实施重复验证实验。
“【记录历史】谁重复验证了NgAgo？”将持续跟进。
特例留档：
由于以下关于NgAgo重复验证实验的发布情况比较特殊，发布人背景未知，特于其发布
人实验结果完全公布之前，留档记录
- 2016年8月8日，joshhaha@mitbbs在mitbbs biology 版发布了“如何验证韩春雨
老师的NgAgo编辑基因作用？虚心学习”的文章 （Note-2）。发布人宣称正在使用“韩
老师送来的NgAgo DNA (N)”进行重复验证实验。
- 按其发布的实验设计相关细节，并未遵循韩春雨实验室于2016年8月8日在Addgene
更新的实验流程。
- 于2016年8月13日，[email protected]/* */更改了原始发布信息，删除了NgAgo DNA来源
以及删除并更改了一... 阅读全帖 |
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c********n
发帖数: 225 | 41 鉴于在韩春雨实验室2016年8月8日于Addgene更新了实验流程 （Note-1）之后，
已有具有可靠科研训练基础及科研诚信度的研究人员们，在2016年8月8日之前重复验证
NgAgo基因组编辑功能失败之后，宣布基于韩春雨实验室更新发布的试验流程，开始重
新实施重复验证实验。
“【记录历史】谁重复验证了NgAgo？”将持续跟进。
特例留档：
由于以下关于NgAgo重复验证实验的发布情况比较特殊，发布人背景未知，特于其发布
人实验结果完全公布之前，留档记录
- 2016年8月8日，joshhaha@mitbbs在mitbbs biology 版发布了“如何验证韩春雨
老师的NgAgo编辑基因作用？虚心学习”的文章 （Note-2）。发布人宣称正在使用“韩
老师送来的NgAgo DNA (N)”进行重复验证实验。
- 按其发布的实验设计相关细节，并未遵循韩春雨实验室于2016年8月8日在Addgene
更新的实验流程。
- 于2016年8月13日，[email protected]/* */更改了原始发布信息，删除了NgAgo DNA来源
以及删除并更改了一... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 44 不知道大家发现没有，HAN文章里的质粒与ADDGENE里是不一样的。
对于Supplementary Figure 4第一张图，想知道他是用的什么抗体。
因为ADDGENE 里面的NLS-NGAGO质粒是没有标签的。
而且文章里面说nls-ngago质粒的骨架是pcDNA3.1，但是ADDGENE里面的骨架是pEGFP-N1
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发帖数: 1 | 45 For those who can not access the link
I copied the content here:
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
NgAgo
15 posts by 9 authors
Davide Seruggia
Jun 23
Hi,
I tried a couple of transfections with the NgAgo plasmid from Addgene and
the 5'P oligo against GFP from the paper, but I did not see a dramatic
reduction in GFP+ as seen using Cas9 and a GFP sgRNA.
Anybody tried as well and came to the same (dead) end?
Davide
k*****[email protected]
Jun 24
Hi, Davide,
I tried th... 阅读全帖 |
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c********n
发帖数: 225 | 46 第一类“重复” 验证实验信息：匿名或无记名，网络、论坛发布
-成功重复、拓展验证韩春雨NgAgo实验
-包含无任何实验细节描述，无发布方城市，国家等细节的信息发布
-不包含以韩春雨名义单方发布的信息
- 发布方：未知
- 发布时间：2016年8月4日
- 发布平台：google Pooran's NgAgo Survey
- 发布方国家：未知
- 发布方城市：未知
- 发布方研究机构：未知
- 实验室PI：未知
- NgAgo的来源：未知
- 重复验证实验结果: 成功重复、拓展验证韩春雨NgAgo实验
- 重复验证实验详细信息：未知 - Survey 选项：NgAgo works，observed indel
and epitope tag knock-in
- 实验数据发表状态：无
- 实验数据发表的科研杂志：无
注：
- 2016年8月4日，Addgene blog发布的数据显示， 在blog发布前
-- 165 researchers 参与了google Pooran's NgAgo Survey
-- 88... 阅读全帖 |
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c********n
发帖数: 225 | 47 第四类“重复” 验证实验信息：实名, 网络、论坛发布
- 重复、拓展验证实验不能支持NgAgo基因组编辑功能
- 包含有具体实验信息（eg实验材料，步骤，etc）以及发布方具体信
息的发布报告
- 需包含发布时间
- 建议注明是否应用2016年8月8日韩春雨组在Addgene更新的Protocol的相关条件
信息简述：
- 发布方：Yuichiro (Ichi) Miyaoka 宮岡佑一郎 博士
- 发布时间：2016年8月16日
- 发布平台：twitter
- 发布方国家：日本
- 发布方城市：东京
- 发布方研究机构：Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science東京都医
学総合研究所
- 实验室PI：Dr Yuichiro (Ichi) Miyaoka 宮岡佑一郎 博士
- NgAgo的来源：Addgene
- 应用验证实验结果: 无法验证韩春雨NgAgo基因编辑的实验结果
- 应用验证实验详细信息：
−参考2016年8月8... 阅读全帖 |
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c********n
发帖数: 225 | 48 第一类“重复” 验证实验信息：匿名或无记名，网络、论坛发布
-成功重复、拓展验证韩春雨NgAgo实验
-包含无任何实验细节描述，无发布方城市，国家等细节的信息发布
-不包含以韩春雨名义单方发布的信息
- 发布方：未知
- 发布时间：2016年8月4日
- 发布平台：google Pooran's NgAgo Survey
- 发布方国家：未知
- 发布方城市：未知
- 发布方研究机构：未知
- 实验室PI：未知
- NgAgo的来源：未知
- 重复验证实验结果: 成功重复、拓展验证韩春雨NgAgo实验
- 重复验证实验详细信息：未知 - Survey 选项：NgAgo works，observed indel
and epitope tag knock-in
- 实验数据发表状态：无
- 实验数据发表的科研杂志：无
注：
- 2016年8月4日，Addgene blog发布的数据显示， 在blog发布前
-- 165 researchers 参与了google Pooran's NgAgo Survey
-- 88... 阅读全帖 |
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c********n
发帖数: 225 | 49 第四类“重复” 验证实验信息：实名, 网络、论坛发布
- 重复、拓展验证实验不能支持NgAgo基因组编辑功能
- 包含有具体实验信息（eg实验材料，步骤，etc）以及发布方具体信
息的发布报告
- 需包含发布时间
- 建议注明是否应用2016年8月8日韩春雨组在Addgene更新的Protocol的相关条件
信息简述：
- 发布方：Yuichiro (Ichi) Miyaoka 宮岡佑一郎 博士
- 发布时间：2016年8月16日
- 发布平台：twitter
- 发布方国家：日本
- 发布方城市：东京
- 发布方研究机构：Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science東京都医
学総合研究所
- 实验室PI：Dr Yuichiro (Ichi) Miyaoka 宮岡佑一郎 博士
- NgAgo的来源：Addgene
- 应用验证实验结果: 无法验证韩春雨NgAgo基因编辑的实验结果
- 应用验证实验详细信息：
−参考2016年8月8... 阅读全帖 |
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