C*******e
发帖数: 4348 | 1 乘着这会儿人气高，求教一个PCR中遇到的问题哈，说实在的这是第一次遇到这么诡异的PCR问题，
这么多年下来大大小小各式各样的PCR都做过，扩增大于10kb都没有遇到过不知道如何trouble
shooting的时候。
最近从某个E.coli plasmid里PCR一个非E.coli的origin X(这个plasmid既有Ecoli的
origin又有另外某个细菌X的origin X，既可以在E.coli里维持也可以在细菌X里维持)。这个
origin X有3.6kb长，照理说用plasmid做模板，3.6kb也不算多长，应该不会太麻烦；可是做下
来跑胶就是干干净净，没有条带，没有primer dimer，没有非特异产物，什么都没有（当然如果模
板plasmid加多一点，能看到模板）；annealing温度梯度，还有别的optimize都做了，还是一
样；还有过用linear plasmid做模板，还是一样。
另外还设计了这个3.6kb区域的5个sequencing primer，因为一直P不出来，就有点怀疑这个
E.coli plasmid，因为是别的实验室给我们的，送去测序以后没有 |
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p********r
发帖数: 565 | 2 走前要开个电影站让大家爽爽,只是收藏性质，请勿外传
需要帐号的给我写信
由于带宽和版权问题，目前只限WISC地区，当然老相识的可以例外:P
只能用PC机看啊，当然你可以在学校当然后带回家看，不过这里最小
的一个文件都是
100MB左右,呵呵，怎么带你自己琢磨吧(ZIP? CDROM?...)
如果要在家用拨号上网来直接当的话，嘿嘿,想想拨号最高稳定传输
速度是5.6KB/S,
100MB/5.6KB=17857 seconds= 5 hours,学校最多只让你连4小时，所
以一定要用续传软件啊
比如leapftp, cuteftp什么的,
anyway, just for your entertainment :-) |
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t*****z
发帖数: 1598 | 3 我有个6.6kb的DNA序列，是某个细菌基因组中的一段。我想知道还有哪些别的细菌含有
这个片段，就做megablast，但是找到的除了自身，就再也没有有意义的hit了。但是我
知道别的基因组里确实有整段的同源序列的。想来6.6kb也不是很大，那该怎么做好呢
？多谢！ |
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l**********1
发帖数: 5204 | 4 >回复]
[ 1 ]
发信人: thomasz (thomasz), 信区: Biology
标 题: ？怎样Blast较大的序列？
发信站: BBS 未名空间站 (Sat Feb 25 14:36:17 2012, 美东)
我有个6.6kb的DNA序列，是某个细菌基因组中的一段
。但是我
知道别的基因组里确实有整段的同源序列的。想来6.6kb也不是很大，那该怎么做好呢
？多谢！
----
and
cited:
------------
出一大堆 somewhat similar to Optimize for Somewhat similar sequences by (blastn)
then what is the next step?
Fishing most important hits?
//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi?
CMD=Web&LAYOUT=TwoWindows&AUTO_FORMAT=Semiauto&ALIGNMENTS=50&ALIGNMENT_VIEW=Pairwi
se&
CLIENT=web&DATA... 阅读全帖 |
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x******o
发帖数: 76 | 5 想把6kb片段连进8.5kb的lentiviral vector里，试了几次都不成功，求助一下。
我是这么做的，单酶切得到6kb insert，切胶纯化，载体单酶切，去磷酸化，切胶纯化
。1:1比例4度连接过夜，转化stbl3感受态42度45秒，recover 1小时涂版，30度过夜，
板子上长几十个斑。挑斑入LB+amp 30度摇过夜，miniprep，酶切鉴定。跑胶时，总是
得到大概2kb的片段，无论是否酶切过。拿最近的一次质粒直接跑胶结果来看，12个克
隆，9个是2kb band，2个是degraded DNA（1-2kb size），1个是5kb左右（经酶切鉴定
可能是contamination）。 现在基本怀疑是LTR重组导致片段丢失，觉得自己已经考虑
了很多可能导致LTR重组的因素，所以只能问问大伙有什么建议。 |
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f***y
发帖数: 4447 | 6 摆脱arm
https://laoyaoba.com/html/news/newsdetail?source=pc&news_id=726307
（集微网报道 艾檬）MCU市场的竞争将开启RISC-V核的新航道？
在国内32位基于ARM Cortex-M通用MCU市场占据探花之位之后，兆易创新GigaDevice持
续精进，在行业内率先将开源指令集架构RISC-V引入通用MCU，正式推出全球首个基于
RISC-V内核的GD32V系列32位通用MCU，并提供程序代码库、集成开发环境、嵌入式操作
系统、云生态、开发板等完整工具链支持。有备而来的兆易创新将在RISC-V MCU市场掀
起多大的浪花？
打造GD32百货商店
作为GD32系列的新成员，先来看看光环加身的GD32系列家族的发展。
兆易创新执行副总裁、MCU事业部总经理邓禹表示，GD32系列主要是基于ARM Cortex-M
系列的32位通用MCU产品，拥有320余款产品型号、22个产品系列以及11种不同封装类型
，实现高性能、低成本和易用性，涵盖入门级、主流级、高性能增强型等应用，累计出
货量超过3亿颗，客户数量超过1万家，覆盖率... 阅读全帖 |
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k******t
发帖数: 1498 | 7 DO vs. linode的讨论最近几年比较多，板上有没有人有实际的运行经验？分享下最近两
周的经验。
鄙人的应用相对简单，接收传感器网络的数据，验证然后存储到数据库中。验证比较费
CPU，运算量大概占1/3. 数据量很小，网络不是瓶颈。大规模部署之后disk高频读写可
能会有问题。小规模的实验包括5个终端带50个传感器。数据量6KB每分钟，最高并发10
.
部署到linode的那个1Core 1G Ram的node上之后，小规模运行之后发现大概0.1%的HTTP
post request没有被成功处理。因为以前开发过程中运行在digital ocean的那个最便
宜的1core 512M ram的droplet上一直没有出过问题，这两周做trouble shooting，就顺
便比较了一下DO和linode在高并发时候的性能。
digital ocean 和linode 用的都是1 core ，1G Ram， 服务器一个在Fremont CA，另一
个在san Francisco CA，我从东湾通过comcast宽带接入。
用 Jmeter 做短时间（3～5分钟）压力测试，50 th... 阅读全帖 |
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t******s
发帖数: 935 | 8 critter crunch and tank battles. Have not decide if I will get braid. If I
do, then I will share that, too.
first 4 people reply this post get. I will start to handle them after work
today by pm(~6pm)
Please specify which game you want. For those who want CC, please download
the demo first. In that case, you only need to get another 6kb activation,
making the process faster.
BTW, anyone knows if I can send the code only since I got them from amazon?
or we still have to share the PSN account like |
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l******a
发帖数: 3339 | 9 首先声明，本人既不用qq，也不用360，纯属看客，这个帖子跟qq也没有任何关系，完
全是针对360。
这阵子大水已经过去了，本来不应该再发关于360的帖子了，不过刚才用一个软件（星
际管家，用户群比较有限的小软件），居然说升级就必须卸载360。弄的我一头雾水，
不知道这个软件的作者想干什么，qq都河蟹了，你一个小软件折腾啥啊，找灭吗？搜了
一下，终于发现360网络黑社会的内幕了。另外360宣称qq上传用户隐私，其实他自己才
是真正的在窃取用户隐私。另外最可恨的是，360的杀毒技术非常差，而很多被查杀的
木马其实都是他自己造的！！！
这是星际管家作者的原帖，关于为什么不兼容360，相信应该不是枪手：
http://bbs.sc2manager.net/showtopic-390.aspx
这是360内幕的原帖，1年前的老帖，所以肯定不是3q大战的网文：
http://bbs.duowan.com/viewthread.php?tid=15223322
打不开的朋友，我帖子转载如下：
解密360安全卫士黑幕：离职奇虎360老员工的告白0
解密360黑幕：离职奇虎360老员工的告白
从372... 阅读全帖 |
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c****t
发帖数: 19049 | 11 13. 红红红红岸之三
红岸工程部分文件，这批文件的解密时间是叶文洁向汪淼讲述红岸内幕三年之后。
一、世界基础科学研究趋势中一个被忽略的重要问题（原载《内部参考》196口年口月
口日）
【提要】从近代史和现代史上看，科学基础理论研究成果转化为实用技术有两种模式：
渐进型和
突变型。
渐进型：基础理论成果被逐步转化为应用技术，技术逐渐积累，最后产生突破。最近的
例子有宇
航技术的发展和突破。
突变型：基础理论成果被迅速转化为实用技术。产生技术突变。最近的例子是核武器的
出现，直
到四十年代，还有一部分最优秀的物理学家认为释放原子能是永远不可能的事。但核武
器在极短
的时间内突然出现，基础科学向应用技术的转化跨度极大，时间极短，我们定义为技术
突变。
目前，北约和华约集团基础研究空前活跃，投入巨大。所以一项或多项技术突变随时都
可能发生
，这将对我战略规划构成重大威胁。
文章认为，我们目前的目光主要集中在技术的渐进型发展上，而对可能发生的技术突变
没有给予
足够的重视。应当从战略高度，制定一套完整策略和原则，当技术突变发生时能够正确
地应对。
文章列出最有可能发生技... 阅读全帖 |
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c****t
发帖数: 19049 | 12 ☆─────────────────────────────────────☆
casact (尝尝也) 于 (Fri Jul 22 20:55:29 2011, 美东) 提到:
刘慈欣
《三体》终于能与科幻朋友们见面了，用连载的方式事先谁都没有想到，也是无奈之举
。之前就
题材问题与编辑们仔细商讨过，感觉没有什么问题，但没想到今年是文革三十周年这事
儿，单行
本一时出不了，也只能这样了。
其实这本书不是文革题材的，文革内容在其中只占不到十分之一，但却是一个漂荡在故
事中挥之
不去的精神幽灵。
本书虽不是《球状闪电》的续集，但可以看做那个故事所发生的世界在其后的延续，那
个物理学
家在故事中出现但已不重要，其他的人则永远消失了，林云真的死了，虽然我有时在想
，如果她
活下来，最后是不是这个主人公的样子？
这是一个暂名为《地球往事》的系列的第一部，可以看做一个更长的故事的开始。
这是一个关于背叛的故事，也是一个生存与死亡的故事，有时候，比起生存还是死亡来
，忠诚与
背叛可能更是一个问题。
疯狂与偏执，最终将在人类文明的内部异化出怎样的力量？冷酷的星空将... 阅读全帖 |
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J*******3
发帖数: 1651 | 14 Sandy Bridge展望
泡泡网笔记本频道1月11日 2011年1月6日注定是个不平凡的日子，在这一天全球最
大的电子消费大展CES 2011在美国赌城拉斯维加斯拉开序幕，去年从头火到尾的苹果也
选择在这一天推出Mac App Store在线商店，而让这一天更加不平凡的便是Intel推出全
新的Sandy Bridge平台，必将引领2011年硬件、笔记本、台式机等领域的重大变革。
浮云还是板砖 Sandy Bridge能飞多久?
Click Here
如果说Intel推出的平台是产业的“领导者”和“定义者”，那么一定会有某些竞
争对手反驳，同时他们也正将此转化为行动，维持住一定市场份额，Sandy Bridge的诞
生虽得到热捧但也受到了一定程度的阻击，该如何面对强劲对手，该如何踏平2011年，
它还有许多路要走，未来的一年里Sandy Bridge到底能火多久？能飞多久？我们一起煮
酒论英雄。
Sandy Bridge简介
Sandy Bridge是英特尔即将在2011年的发布的新一代处理器微架构，仍然保持酷睿
i3、i5、i7三个系列分别针对入门级... 阅读全帖 |
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h*******g
发帖数: 10 | 15 Dear brothers and sisters,
Would you please tell me how can I connect my cell phone to my laptop to get
internet access? I am currently using Tmobile T-zone without internet plan. My
phone is Motorolla V66. When I connect it to my laptop using a data cable, it
shows a 115.6KB connection and can send some and receive some data through
GPRS service, but it never connects to any website. Do I have to pay $19.99 to
get internet access from T-mobile? Could you tell me what's the problem?
Thanks. |
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x******n
发帖数: 1 | 16 csrss 频繁出对话框， 求助。
WinXP，开机不长时间，csrss就频繁跳出对话框，
'AM' is not a valid integer value.
搜索电脑csrss，发现
csrss.exe， C:program Files, 179 KB
CSRSS.EXE-03323C54.pf, C:windowsprefetch, 25 KB
CSRSS.EXE-35A6A30E.pf, C:windowsprefetch, 23 KB
csrss.exe, C:windowssystem32, 6kb
CSRSS.EX_, C:I386, 3KB
使用hijackthis， 发现以下内容，请各位大侠指正。
Logfile of HijackThis v1.99.1
Scan saved at 10:33:52 AM, on 12/24/2006
Platform: Windows XP SP2 (WinNT 5.01.2600)
MSIE: Internet Explorer v6.00 SP2 (6.00.2900.2180)
Running processes:
C:WI |
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y**********d
发帖数: 217 | 17 谢谢。刚才安装了控件试了下，传得好慢啊 6kbs. 10MB的文件要上传2个多小时。
不知道是不是只是我家这样。 |
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x********u
发帖数: 430 | 18 愿闻其详
我最近刚做好一个4.6kb, 另一个1.5kb,也打算将他们连接起来。
to |
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j******i
发帖数: 939 | 19 6kb should be OK. I have done with 7kb. |
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j******i
发帖数: 939 | 20 I mean insert 6kb into lenti backbone. |
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p******i
发帖数: 1092 | 22 我把TLR4 cDNA (2.6kb)从macrophage里PCR出来，加上XhoI和BamHI，接到
pEGFP-N1里，测序结果也是正确的，就是TLR4后面接了个in frame fusion的EGFP
但问题是transfect到293T里不亮，而空载体pEGFP-N1很亮……
我现在怀疑是kozak不够强，准备在ATG前面加一个
GCCACCATGGXX，不知道会不会有帮助……
哪位做过类似的实验，请不吝赐教啊，
在下先谢过了…… |
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s********n
发帖数: 2939 | 23 5 kb不算长吧，如果只是鉴定用的话用一般的Taq应该没问题的，Fermentas的DreamTaq
便宜量又足，manual说可以扩增genome 6kb片段和viral的20 kb片段。我用来检测过3
kb片段。 |
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a********k
发帖数: 2273 | 24 genscript can do that, less than $0.5 per bp for large gene synthesis. We
had a 6kb gene synthesized by them, correct clone. |
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w***y
发帖数: 493 | 25 基因大概有2.6KB, PCR克隆后链接到质粒里然后转到E.coli里面扩增，做小抽然后把质
粒送去测序发现基因的两端都连进去了但是中间部分丢失。测序过几次丢失的部分好像
没什么规律，有时2kb,有时800bp。 PCR的产物还没有测序，因为看size是正确的。请
问这种情况是怎么回事？是不是菌种的问题呢？这个基因是zebrafish的基因。谢谢 |
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b******s
发帖数: 1089 | 26 如果只是单个entry vector到destination vector，效率很高。
我做过大于6KB的都没问题。
但是我做multisite 3-way recombination效率极其低，还有很多false positive。 |
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e****p
发帖数: 354 | 27 Northern 已经看到基因的大小在11kb左右（用RNA LADDER)。
但但转录后 LONGRANGE PCR，扩增中间一段应该是8KB，用PFU扩出来只有最清晰的6KB
左右，重复了一次还是这样，百思不得其解。。。
此外如果CLONE 长练PCR产物，基因中如果有>4KB重复序列如何测序啊，每次只能测个
600-800, 引物设计也是问题。。。
请教各位大侠。 |
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C*****h
发帖数: 926 | 28 lentivirus的包装极限是~10kb，另外，virus产量与size成反比，
一般来说，size增加1kb，virus产量减少十倍。
你的蛋白太大，编码序列本身就有>6kb，再加上virus自己的序列，可能超过10kb了。 |
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n******7
发帖数: 12463 | 29 大致算了一下：
假设一个细胞一套基因组，人是3B个bp，双倍体就是6B
细胞数google一下，77kg的成年人大概6KB个细胞
乘起来就是36 KBB，3.6x10e23
一个base是 3.4埃,3.4x10e-10
乘起来大概就是10e14m = 10e11 km
地球到太阳是 1.5x 10e8 km
大概是700次，往返350次，跟据说的在一个数量级 |
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l*****i
发帖数: 1163 | 30 是6kb＋2kb的连接好连，还是4kb＋4kb的好连（黏末端，连接产物都一样）？
谢谢！ |
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x********u
发帖数: 430 | 31 Is it possible that I insert a 6Kb fragment into a 8Kb vector? I have
repeated three times and have no luck geting any colonies. For construct
below 10Kb, I am very confident (>80%) and I can always get the right
transformants after screening. Is there any tricks for this big fragment
cloning? I know all my gene can be functionally expressed in E coli, so
there is no protein toxicity issue. |
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i*****i
发帖数: 154 | 32 contig express当然可以用来看abi峰值图，我自己大概用了4-5年了，非常好用。
虽然我克隆的基因都不大，2-6kb，最多的时候也就align 12个片段左右。
可以下载一个绿色版本来，放在USB上就可以了。 |
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K**4
发帖数: 1015 | 33 哦，没有看仔细，
那么6kb的dna序列，只有2k的蛋白质阿
很小的
你用blastx 就可以了 |
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b******n
发帖数: 4225 | 34 在细菌中，长达6.6kb的片段不coding任何东西很少见的
如果有，一般是rRNA
VIEW=Pairwi
10&FILTER=L
Translations&
OVERVIEW=on&UNGAP
blastn)
VIEW=Pairwi
10&FILTER=L
PROGRAM=blastn&S
HTTPGET=Yes&SH |
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j****x
发帖数: 1704 | 35 Lentivector的包装极限在10kb左右，事实上超过6kb以上就得拼人品了。包装效率和包
装大小成几何反比，大小增加一个kb，效率就可能下降一个数量级。10kb的插入片断，
劝你不要考虑了，太碟中谍了。。。 |
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Z******5
发帖数: 435 | 36 多谢楼上两位。
病毒最后包装的部分应该是HIV-5'LTR到HIV-3'LTR之间的部分吧。pll3.7载体上这部分
大小是5kb，我改造后大小是6kb。我要分别构建两个转录因子的载体，一个是500bp，
另一个1.4kb。我想应该没什么问题。 |
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s******a
发帖数: 472 | 37 谢谢。
突然意识到我可能做不了long range PCR。我正在做的两个targeting vector A和B，A
的long arm和short arm分别是7kb和5kb；B则是6kb和3kb。3-5kb的基因组PCR应该很难
P吧？
PS，是不是没有必要整这么长的homologous arm？天真的想法是越长越好。。。
homology |
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s*******s
发帖数: 623 | 38 一个6kb左右的基因，具有9个大约450bp的重复区域
很难扩增出来
请问有何高招没有？
谢谢！ |
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l**********1
发帖数: 5204 | 39 please try direct micro injection donor mtDNA to your target organism.
please refer
Takeda K et al
Influence of Intergeneric/interspecies Mitochondrial Injection; Parthenogenetic Development of Bovine
Oocytes after Injection of Mitochondria Derived from Somatic Cells. (2012)
J Reprod Dev. 2012 Mar 9. [Epub ahead of print]
PubMed link:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22447326
Ps:
two us mentors of this aspect in Auburn University
College of Veterinary Medicine
Auburn, Alabama
a) MICHAEL H. IRWIN... 阅读全帖 |
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x**2
发帖数: 255 | 40 www.genewiz.com
1.6kb我拿到的报价是600美元 |
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F*K
发帖数: 608 | 41 我核实过这个质粒的测序结果，序列包括酶切位点在内没有问题。
质粒5.6KB，insert 2.2kb。 |
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s******r
发帖数: 2876 | 42 A or B单切的话是多大，7.8kb？跟空载体比过吗？
我核实过这个质粒的测序结果，序列包括酶切位点在内没有问题。
质粒5.6KB，insert 2.2kb。 |
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S***6
发帖数: 431 | 43 Insert的基因全长4.6kb，载体3kb。
一开始用一种Fast cloning的方法，就是对载体和Insert都PCR，然后两个接头处保留
有16-18bp的overlap，混合后直接转化E.coli，这种方法在我们lab对于3kb一下的
subcloning都非常有效。可惜得到的是部分插入的克隆，只插进去N端的200bp和C端的1
.3kb，分析后怀疑是Insert的序列中包含6bp的重复序列，可能发生了self-
recombination。
现在回到传统的方法，PCR后先连接到T 载体，但是也还是得到部分插入的克隆，这次
插入的序列只有N端的大约1kb左右。
现在这个Insert只是从RT 产物中得到的PCR 片段，所以无法突变修改容易引起自我重
组的序列。
另外一个怀疑的地方是现在的连接酶太高效了，连接只需要5分钟到15分钟，这么高效
的连接是不是也很容易造成DNA片段内部的重组啊？形成一个Loop，然后一大段中间序
列就这样miss了。
大家帮我分析一下这种大片段丢失的现象究竟是Insert中含有容易自我重组的序列，还
是连接酶造成的？还是两个因素可能都发挥了作用？还是... 阅读全帖 |
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f*******2
发帖数: 14 | 44 If you are interested in sequencing the full-length 16s rRNA gene, PacBio
might be another choice. I have done some sequencing of 1.6Kb 16s RNA with
PacBio. So far data looks good. Let me know if you want more info. |
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s********n
发帖数: 2939 | 45 Genscript应该可以帮你做的，你可以把你的要求告诉他们，他们还是很positive的。
不过6kb的话估计会有点贵（单个碱基价），如果不care价钱的话就无所谓了。而且很
成的时间比较长。Genscript合成3kb以下的价格很低，但大于3kb的会贵一些，越长越
贵。你也可以考虑拆成两段（3kb+3kb），再自己assemble。
我现在基因合成基本上都在Genscript做，支持中国的企业，而且他们的服务很好，至
今为止还是很满意的。还有就是如果你合成基因多而且都是克隆在同个载体的话，可以
让他们set up一个custom vector，只收setup fee，他们合成基因后就可以免费克隆到
这个载体上，所以你就不用自己做克隆了。
DNA |
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B****w
发帖数: 48 | 46 我有一个质粒6KB左右，用PCR扩增了其中一个1KB的片段，然后用这个1KB的片段作
primer，直接扩增整个质粒，用高保真的酶，就相当于QuikChange，是否可以扩增整个
质粒？ |
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j******i
发帖数: 939 | 47 6kb插到8kb是很难的，这不是个别现象。可以尝试高溶度的t4 ligase（biolab), t7
ligase, Gibbson Assembly. |
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