Z******5
发帖数: 435 | 1 大肠杆菌貌似20分钟一代。
其实一般摇40分钟左右，就是防治在没有抗生素的情况下，阴性菌会富集的太多。 |
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T*****e
发帖数: 315 | 2 本来应该摇1h, 但是因为其他事情忘记了，摇了6个小时，如果现在涂板的话有什么副
作用吗？ |
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s******s
发帖数: 1584 | 3 没啥副作用，就是杂菌会多长点吧，多挑几个克隆就好了。 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 4 摇20小时有可能太久了，如果菌长太密了，养分和氧气耗尽的话，菌体自身含有的溶原
性噬菌体可能会进入裂解周期，这样就会出现类似噬菌体感染的菌液变清，菌量减少的
情况。你把摇菌时间减半试试。或者降低摇菌温度，这样细菌长得慢。 |
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s******y
发帖数: 17729 | 5 结构生物学对于生化，生物物理甚至物化都有很高的要求。至于施公公或者说绝大部分
搞结构的实验室的搬砖的民工，主要停留在摇菌，刷瓶子，刷罐子（有的实验室为了又
多又快的长晶体，2L的玻璃瓶显然不能满足需要，上罐子），然后守着离心机倒上清液
收沉淀的阶段。
对结构生物学啥也不懂，其实也不需要懂
每天绝大部分时间都献给了我上面说的几个过程，比工地搬砖还累。弄到蛋白了，然后
才是结构。
所以很多做结构的民工除了摇菌，纯化蛋白，看显微镜，两眼抹黑。
最擅长的也就是把菌摇成稀屎一样恶心的黄汤，然后离心收菌，算了不说了，越说越想
起那段恶心的岁月 |
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b**********8
发帖数: 349 | 6 我之前做TA的时候也遇到过这样的情况，我要的是反向链接的，不过连续挑了30几个都
是正向的。后来老板告诉我挑克隆的时候注意同时挑一些个头大的菌落和个头小的菌落
。我发现那些个头小的过夜摇菌的时候长的很差，不是那种均匀的浑浊，而是一团白色
的粘糊糊的附着在tip上，其实之前那30个里我也遇到过这样的，当时以为是污染了于
是把菌液丢掉了，没有抽提。最后那次把所有的菌液抽提，经酶切验证发现那些个头小
的摇菌后呈白色团块状的就是我要的。后来猜测估计反相连接的序列可能会在菌体内表
达某些有毒性的蛋白，所以不容易挑到。 |
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S***a
发帖数: 257 | 7 我刚遇到类似的问题解决了，希望解决方案对你有帮助。
我的质粒表达hairpin shRNA,对细菌有毒性。涂板的时候克隆长出来没有问题，但是摇
菌的时候长的不好，拿到的质粒dna浓度很稀。
我是买来的质粒，所以打电话问了公司客服。他们建议：
1.用 terrific broth (TB)而不是普通LB摇菌；
2.用 carbenicillin，不要用Ampicillin (如果你的细菌是amp抗性的话）；
3.如果还不行，可以尝试room temperature 摇菌两到三天。
我的问题换了TB就解决了，祝你好运！ |
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m****m
发帖数: 395 | 8 膜蛋白难表达是很正常的事。
先把各种可能性一一排除，然后确定原因。各个击破。一次改变一个条件，一次解决一
个疑问。
关于测序的事，如果可以的话，还是想想办法做一下。
先从涂板开始，每个菌落小量摇菌，检测质粒的存在，还有生长活性。标记好有质粒的
菌，挑选最有活力的菌进一步做表达蛋白，有几个问题需要解决：OD生长到多少的时候
开始换培养基最好？（一般是对数生长期吧，不过自己也可以试一下在不同生长期）。
更换培养基后，多久以后开始诱导？（我一般是1个小时以后，不过你可能不同，要试
一下）。分几个不同的温度进行诱导（更换培养基后就用这个温度）、诱导多久后膜蛋
白表达量最高？（这个就要麻烦你要每隔一段时间取点菌去测一下有没有蛋白了）最后
决定最佳诱导温度和时间，还有你说的IPTG量的问题，也可以试一下，抗生素的浓度也
要控制好，太高菌就不长了，太低么要长杂菌。最后裂解细菌，看你用什么方法了，裂
解完离心后膜蛋白有可能在上清液里，也有可能在PELLET里。确定这个以后，就可以开
始纯化了。总之每个步骤都要严格监控，别把蛋白弄丢了。
小小建议呈上，希望对你有所帮助，祝你成功~ 实在不行，最后可以去做 |
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s*****h
发帖数: 108 | 9 转到细胞双链DNA，我知道如果瞬时转染，DNA 将不能整合到基因组去，但是如何会有蛋白产生？ 非常疑惑 。
我不知道这一段DNA是如何进入细胞核的，进去了，一直处于游离状态，人家细胞自己
的DNA开始转录，可外来的DNA自己又没有promoter，怎么开始转录成RNA啊？
另外一个问题，是不是转染到细胞里，双链线性DNA，环状DNA，都可以？ 那单链DNA可以吗？
还有一个问题，我们平时摇菌，扩质粒，这些质粒都自己可以独立复制的吧，都是基本不整合到细菌基因组的吧。我们摇菌用的细菌自己有自己的质粒对不对？
分生非常差，不好意思，谢谢！ |
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t****p
发帖数: 1504 | 10 这个现象我以前碰到过，丢失的序列是TA rich，或者重复序列。最后解决的办法是降
低菌的生长浓度，包括转化以后和摇菌，都用30度以下的温度。
stellar，还有promega的。 |
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y***i
发帖数: 11639 | 11 拿这个菌做实验是挺可怕的。做LB plate，摇菌，得用多少砷啊。 |
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r*****t
发帖数: 4793 | 12 谢谢大家。如果是phage， 有什么办法去掉？用这个MAX Efficiency® DH5α&#
8482; T1 Phage Resistant Competent Cells做转化？
另外摇菌的时间不到20小时，菌落应该不是卫星菌， |
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h**********r
发帖数: 671 | 13 如果把你这个NB的DNA，转到NEB的那个长的快的菌里面，会怎么样？会不会吃顿饭的功
夫就长好了？
另外，top10有时也挺招人烦的。早上做转化吧，得熬夜挑克隆。下午想做完转化早点
回家，第二天早上一不小心又出卫星菌落了。上午挑完克隆摇菌，晚上又得熬夜提质粒
酶切跑电泳。
有时为了省个一天半天的真是累死人。 |
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m******e
发帖数: 459 | 14 非常同意这位仁兄的看法，对于Amp抗性菌，先小量摇菌再扩大培养是下策 |
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发帖数: 1 | 15 屎一共动个鸡巴的疫苗
这孙子成天就知道招一堆民工摇菌然后纯化蛋白，在电镜房拍大分子裸照
俗一点就是用个大罐子把培养基摇成屎一样的黄汤，然后到离心机里面
拍大分子裸照的时候再趁机猥亵一下女徒弟 |
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H*********a
发帖数: 133 | 16 我曾遇到跟你类似的情况，也是新去一个实验室，也是从前的vector构建老手，但就是
怎么也转不出克隆来，找了无数原因。后来发现了一个极低级的，致命的错误。
我以前的实验室，LB板是技术员制备的，到了新实验后，LB板要自己制备，问题就出在
制备LB板上。
LB Agar应该直接溶解在water里，而我想当然地认为是agar，就溶解到LB溶液了。结果
就是，转化后怎么也不出克隆，24小时候能见到很小的克隆，挑出来摇菌都摇不起来。
你的原因也许不一定一样，但我的建议是，仔细检查一遍每个细节，哪怕最简单的细节
。 |
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s******y
发帖数: 17729 | 17 若干年以后，结蛋白结构就行做个TA克隆电转化一样，不对步骤多些，摇菌就要摇好几
大桶老费劲了 |
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发帖数: 1 | 18 没几个好东西，都是曲，还互相摇，没办法，大环境如此，跟共匪统治的山东一样 |
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l********k
发帖数: 14844 | 19 也曾经来美新和右派打嘴仗，维护工会的利益，痛斥贫富分化。那时的买买提还没有器
人，菌斑还在讨论飞机和奥运。我是个爱国小将，见不得米帝的好。各种抨击万米邪恶
的制度、揭露对华的双重标准。那时候的美新是一滩死水，偶尔有我这样的爱国小将过
来踢场子。
后来见多了天使的"美好"、非移的"坎坷"，听到师兄和前辈们感叹孩子的艰难，觉得自
己和liberal为这些"minorities"摇旗呐喊是何等的傻逼。在后来，毕业了，上班了，
拿着工资单，骂道：凭他妈什么！苦等绿卡不来，眼见非移们成群结队有说有笑地往来
穿梭，自嘲：哥也去趟墨西哥，把护照一撕，摇身变成Juan Carlos Garcia，扒个火车
回来，找个中餐馆干两年，啥都有了。
再后来，有了儿子。看着他天真的傻脸，就觉得对不起他：爸妈给你生错了肤色... 你
一生下来就已经比别的孩子落后了。别问我为什么，爸答不上来。
今年，眼前一亮，终于愿意被代表了。身处深蓝州，翘班去听了拉力，米帝大农村难得
一见的人山人海。掌声、呼声、口哨声...
然后就是媒体一边倒的掩盖、粉饰、转进、袒护，和诋毁、造假、洗脑、抹黑。目睹二
十一世纪标榜自由世界灯塔的... 阅读全帖 |
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m*****u
发帖数: 19562 | 20 10多年前没有美新吧？ 那个时候骂老将得去沙龙版
[在 lunchbreak (码蛋) 的大作中提到：]
:也曾经来美新和右派打嘴仗，维护工会的利益，痛斥贫富分化。那时的买买提还没有
器人，菌斑还在讨论飞机和奥运。我是个爱国小将，见不得米帝的好。各种抨击万米邪
恶的制度、揭露对华的双重标准。那时候的美新是一滩死水，偶尔有我这样的爱国小将
过来踢场子。
:后来见多了天使的"美好"、非移的"坎坷"，听到师兄和前辈们感叹
孩子的艰难，觉得自己和liberal为这些"minorities"摇旗呐喊是何等的傻逼
。在后来，毕业了，上班了，
:拿着工资单，骂道：凭他妈什么！苦等绿卡不来，眼见非移们成群结队有说有笑地往
来穿梭，自嘲：哥也去趟墨西哥，把护照一撕，摇身变成Juan Carlos Garcia，扒个火
车回来，找个中餐馆干两年，啥都有了。
:再后来，有了儿子。看着他天真的傻脸，就觉得对不起他：爸妈给你生错了肤色...
你一生下来就已经比别的孩子落后了。别问我为什么，爸答不上来。
:今年，眼前一亮，终于愿意被代表了。身处深蓝州，翘班去听了拉... 阅读全帖 |
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l******u
发帖数: 1174 | 21 好奇版上有没有来美十年以上还是小将的？15年呢？
：也曾经来美新和右派打嘴仗，维护工会的利益，痛斥贫富分化。那时的买买提还没有
器人，菌斑还在讨论飞机和奥运。我是个爱国小将，见不得米帝的好。各种抨击万米邪
恶的制度、揭露对华的双重标准。那时候的美新是一滩死水，偶尔有我这样的爱国小将
过来踢场子。
：后来见多了天使的"美好"、非移的"坎坷"，听到师兄和前辈们感叹
孩子的艰难，觉得自己和liberal为这些"minorities"摇旗呐喊是何等的傻逼
。在后来，毕业了，上班了，
：拿着工资单，骂道：凭他妈什么！苦等绿卡不来，眼见非移们成群结队有说有笑地往
来穿梭，自嘲：哥也去趟墨西哥，把护照一撕，摇身变成Juan Carlos Garcia，扒个火
车回来，找个中餐馆干两年，啥都有了。
：再后来，有了儿子。看着他天真的傻脸，就觉得对不起他：爸妈给你生错了肤色...
你一生下来就已经比别的孩子落后了。别问我为什么，爸答不上来。
：今年，眼前一亮，终于愿意被代表了。身处深蓝州，翘班去听了拉力，米帝大农村难
得一见的人山人海。掌声、呼声、口哨声.... 阅读全帖 |
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l***y
发帖数: 4671 | 22 手头正在做 molecular reporter，天天摇菌呢。
e coli 在 exponential phase 大约 17 分钟一代。
http://textbookofbacteriology.net/growth_3.html
Table 2. Generation times for some common bacteria under optimal conditions
of growth.
Bacterium Medium Generation Time (minutes)
Escherichia coli Glucose-salts 17
Bacillus megaterium Sucrose-salts 25
Streptococcus lactis Milk 26
Streptococcus lactis Lactose broth 48
Staphylococcus aureus Heart infusion broth 27-30
Lactobacillus acidophilus ... 阅读全帖 |
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a*o
发帖数: 25262 | 23 文盲下面的是什么？ 不才，不知道。
唉，对牛弹琴，头都提一下头看看。。或许是懂了。可你。。。
说你是文盲 = 我自吹有文化？
牛都摇了摇头。 |
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z**********e
发帖数: 22064 | 24 2016-07-26 微生物研究所 微信号tkwsws
功能介绍
浙江微生物研究所，直属浙江省科技厅，是一家集技术研发、技术服务、成果转化为一
体的研究型技术服务机构。
编辑整理：小静
来源：网络
“啊，雨后的空气，真是清新，让我张开怀抱尽情呼吸吧。”
“那只是放线菌的排泄物”
“今天晒的被子，现在还有阳光的气息。”
“那是烤熟的螨虫。”
“你们搞生物的能不能不要这么毁生活？”
“我还要告诉你真正的玫瑰比月季还要难看几十倍吗？我会告诉你拉面其实很像蛔虫吗
？我会告诉你你吃河蚌其实是吃的人家的生殖腺吗？
“快闭嘴！”
“师妹，你胶配了没有？”
数学是光，点亮物理的灯；
物理是灯，照亮化学的路；
化学是路，通向生物的坑；
生物这个坑，埋葬了我的后半生。
顺我者套袋，逆我者去雄。
分子生物学PhD去超市购物，总价94，他又买了2块钱的东西，心想终于凑了个整数。
高中的时候，女生问男生：“叶子的离去，是风的追求，还是树的不挽留？”
男生说：“是脱落酸。”女生离他而去了。
几年后，他们又相遇了，两个人都比以前少了一份稚嫩多了一份成熟。
女生问：“叶子的离去，是风的追求，还是树的不挽留？”
男生说... 阅读全帖 |
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y***i
发帖数: 11639 | 25 1. 改温度，30度摇菌, 放plate
2. 象你做的，改质粒和细菌。
3. 挑colony时，不但挑大的，也挑些小colony。plasmid有毒性的话，阳性clony 长
得慢。plate 放时间长些，让小colony长大。
stellar，还有promega的。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 26
有蛋白产生？ 非常疑惑 。
Most plasmid for transient expression will carry their own promoter upstream
of the expression codon.
DNA可以吗？
single strand DNA is degraded easily and practically not ideal for
transfection.
本不整合到细菌基因组的吧。我们摇菌用的细菌自己有自己的质粒对不对？
Yes. Most of them have their own replication origin site.
If you look at the vector map you will notice things like "F1 Ori". |
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m****r
发帖数: 383 | 27 在做一个targeting construct,最后一步了，试图把3'arm 和5'arm连起来，可是试了
数月了，还是不行，miniprep出来的多是些小片断。有人说可能是construct在细菌里
发生了重组，建议平板放低温，在低温下摇菌，我都试过了，无果。大家有什么建议？
多谢。 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 28 E.coli的BL21(DE3)pLysS strain。带的质粒是个小质粒，表达的蛋白不大，只有7kD，
没有细胞毒性。用的培养基是LB+M9 salts，抗生素是Amp+Chloramphenicol。关键是以
前摇菌（同一个strain）都没有这个问题，最近屡屡出现，我不知道是哪里
contaminate了，如果是phage的话，就恐慌了，据说很难清除phage。 |
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r****r
发帖数: 379 | 29 一般大片段克隆，会导致连接效率很低，克隆数大大减少，可以看看你的克隆数和你常做的克隆比是不是还比较正常，如果比较正常，那说明这种假阳性很可能是因为你的插入片段有一段序列比较容易发生重组，试着30度长克隆和摇菌看看。另外，能不用单酶切做克隆就不要用，你大片段克隆还用这个策略，最好换其它双酶切。
另外，单就大片段克隆而言，建议用GeneHogs菌株，我手上的片段普遍10k以上，用这个菌株，从来没出现过问题，感受态效率一般7次方就可以了，15kb可以长百来个克隆。
因此建议先更换单酶切策略和换genehogs，然后不行再换30度生长看。30度生长，已发生重组的质粒，一般10个有2个总是对的。
gone
cut |
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b******r
发帖数: 111 | 30 Good idea. My 9kb DNA itself contains too many restriction sites. NotI is
the only choice.
'Description:
Important: GeneHogs® competent cells are being discontinued on December
31, 2007.
Use ElectroMAX™ DH10B™ T1R cells for exceptional performance!
'
常做的克隆比是不是还比较正常，如
果比较正常，那说明这种假阳性很可能是因为你的插入片段有一段序列比较容易发生重
组，试着30度长克隆和摇菌看看。
另外，能不用单酶切做克隆就不要用，你大片段克隆还用这个策略，最好换其它双酶切。
这个菌株，从来没出现过问题，感
受态效率一般7次方就可以了，15kb可以长百来个克隆。
发生重组的质粒，一般10个有2个
总是对的。 |
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h**********r
发帖数: 671 | 31 以前没用过，也没见人在实验室用过，圡。
我在E. coli里克隆表达了luxAB,今天把agar plate上的菌落暴露在decanal下面，没见
有啥反应。这种Luminescence必须要激发光才行吗？还是得先摇菌在液体才能看？
多谢！ |
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v*********d
发帖数: 382 | 32 可以试一下：25-28（RT）摇菌，induce的时候OD提高，时间缩短
BTW，double check your E. coli strain |
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g**********y
发帖数: 423 | 33 有个勤奋的生物学家死后，上帝不想让他去天堂，就把他放到了地狱。
过了一周，阎王来找上帝：敬爱的上帝，麻烦你赶紧把那个生物学家给我弄走，我要恢
复地狱的秩序。现在地狱所有的鬼都在熬夜，加班加点的转质粒，做PCR，摇菌，提蛋
白，走柱子，跑胶，写protocal，攒paper，修改、回复审查意见等，忙得一团糟。小
鬼空闲时都在看paper和review、参加各种技术培训，跟师兄师姐们帮忙......
上帝无奈，把生物学家召回了天堂。
过了一个月，阎王来天宫办事，顺便问上帝：敬爱的上帝，那个生物学家还好吧？
上帝：首先我要说明一点，以后不要叫我上帝，要叫我Professor 耶。另外，我现在很
忙，没有时间回答你的问题，我刚刚接了5个project，马上要连夜开组会。明天一大早
我又要赶去和释迦牟尼谈funding，之前要查看天使们的考勤记录,有事请发电子邮件,
再见 。 |
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c**********r
发帖数: 2372 | 34 照常做就好了，不要省鉴定步骤。
你这不算太长，第二天才想起来那才叫长呢。。。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 35 呵呵，握手握手。这种事情我也做过。照样涂了板，还是能用的。 |
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b******n
发帖数: 4225 | 36 有在SOC里培养过夜第二天才涂板的，人家那叫enrichment |
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s********n
发帖数: 2939 | 37 一般的转化不要紧的，如果是筛选library的话就够呛了 |
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s********n
发帖数: 2939 | 38 这是最优条件下的复制时间，做转化的条件是达不到的 |
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x********e
发帖数: 35261 | 39 1.你克隆promoter的目的是啥？如果是看有没有转录因子调控的话，需要看看ChIP-Seq
等数据，确定enhancer包含在里面了。单纯minimal promoter只要几百bp就够了。
2.克隆模版有两种。一个是自己提纯genomic DNA。1500bp基本上不需要kit，裂解然后
土法提纯一下就p得出。运气好的话直接拿裂解液p都能成功。更好的方式是用BAC做
template。B以前基因组测序的时候别人就把genomic DNA切成小片段放到载体里做成了
library。去blast一下就能得到包含你目标序列的BAC clone。买回来摇菌提质粒，然
后用质粒做模版p，效果比用genomic DNA高很多。
3. 设计引物。一般是取upstream promoter sequence到第一个exon。如果第一个exon
有TSS，引物设计在TSS之前。
4. vector。不知道你做reporter construct的目的是什么，不过luciferase好像多用
于in vitro assay。GFP， lacZ，luciferase等reporter vector中选... 阅读全帖 |
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u*********1
发帖数: 2518 | 40 我正好在做这个，8kb的plasmid，用Pfu貌似没问题，PCR出一堆smear，然后digestion
，transformation
但我接着这里也有俩问题：
1. 从板子上挑选不同的colony摇菌，提质粒，测序，发现有的成功引入突变，有的没
有引入突变，有的甚至出现其他地方（不应该出现的）什么deletion之类的。。
这如何解释呢
2. 8kb的target of interest大概是2.5kb；我现在是设计10对引物覆盖这2.5kb，等于
把整个2.5kb都测一下。。。需要这么做吗？因为虽然大家说Pfu很高保真，但我依然害
怕引入其他的乱七八糟的东西，毕竟PCR的产物是一堆smear。。。其实我都好奇这种
long-range PCR到底发生了什么。。。 |
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s**2
发帖数: 1287 | 41 如果是Amp抗性的话，摇菌别超过14小时。或者用carbenicillin |
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s******y
发帖数: 17729 | 42 结构千老除了摇菌，钻cold room，还有猫地下室暗无天日的看各种显微镜还会干嘛？对
了，拿手戏wb不能落下。 |
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t********9
发帖数: 536 | 43 请教大家在做Clone的时候， 做完Ligation之后，要先走胶检查是否Insert和Vector连
起来了吗，还是直接做Transformation，之后挑单Clone，摇菌，提取Plasmid，测序？
多谢！ |
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j****n
发帖数: 3370 | 46 有钱真好
flask一般要30刀一个？带baffle的貌似50刀起 |
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j****n
发帖数: 3370 | 49 我们实验室之前的美女都是autoclave
说是比bleach好 hehe |
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