j*********n
发帖数: 168 | 1 没有合适的酶切位点，或者空间结构上没有可以互相作用的催化区域吧…… |
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r**h
发帖数: 6 | 2 谢谢指教。
找不到129的BAC，也许意味着129的这个位点没有测序，所以看来比较难比较两个
strain的序列。我自己也许可以PCR出来，自己测，不过感觉事倍功半。我想当然的比
较多，还请指正。
比较遗憾我们使用的service质量不算上乘，做B6 derived，有点战战兢兢。LOL...
谢谢指出这一点。我准备用recombineering，所以希望有BAC。但是如果找不到，就只
能PCR 129 arms，然后一步步酶切连接了。
sequence.
非常感谢你的答复。 |
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c*********r
发帖数: 1046 | 4 两端加上酶切位点,最多长20bp, PCR 产物在50bp左右,这么小的片段好连接吗?
还有其他方法吗? 谢谢! |
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n******d
发帖数: 680 | 5 合成末端磷酸化的互补oligo，然后在TE中变性复性，用T4 ligase连接，oligo记得过
量加
长出来的clone基本都是，不过最好在合成的oligo中设好合适的酶切位点
章也 |
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s********n
发帖数: 2939 | 6 设计oligo的时候可以把粘性末端设计好，链接前可以不用做酶切。
我试过的一个protocol，非常简单好用：
1. oligos用TE or H2O溶解，浓度100 uM；
2. 磷酸化准备如下，37C一个小时, 70C for 10 min.
15 ul H2O + 2 ul oligo (100 uM) + 2 ul T4 ligase buffer + 1 ul TNK
3. 退火反应如下，95C 5 min in PCR cycler，RT for 30 min.
18 ul H2O + 1 ul oligo F + 1 ul oligo R (final 0.5 uM fragment)
这个产物可以直接用于连接。 |
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E*******g
发帖数: 37 | 7 老板考虑到安全的因素，让我从比较新的产品中找一个EB的替代品。从产品公司的广告
和许多同事的推荐中选了几个作了一下比较。
生物学的实验最基本的就是认真仔细。不做不知道，自己一上手就明白是怎么回事了。
上个月刚给本组的同事做了报告，各种产品的优劣都阐述了一下。最后大家一致的结论
是EB最好，目前基本没有可全面可替代的产品。
两个要点，EB的致癌性并没有被证明，只有毒性要小心一些，可毒性作用的最低浓度要
远高于我们一般使用的浓度。而其他产品的毒副作用目前也无法证明。
至于Bio-RED， 大家可以在一个胶上RUN ＤＮＡ MARKER 梯度，从100 ~ 2000 NG，
同时加上两个酶切样品（同样的DNA，一个0.2ug， 另一个2ug）， 结果很明显。不过
如果你不在乎ＤＮＡ大小的准确性那另当别论了。 |
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h***e
发帖数: 146 | 8 >20kb的质粒是不是很难转进去啊？ 还有大家是怎么鉴定的？我每次都用酶切，不好判
断，因为本身都有农杆菌本身就自带质粒。谢谢 |
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h***e
发帖数: 146 | 9 小的很好转的 一般只要抗性有就OK，最好抗生素浓度调高点。PCR也可以的，但是只能
检测部分序列。不过我感觉还是酶切放心，但就是容易降解，带很难分辨。 |
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b******e
发帖数: 61 | 10 多谢楼上的回复。
因为我的目的是想把4kb片断弄到pLenti7.3里边去，没有合适的酶切位点，只好用TA
cloning. 我也试过不用kit里边带的topo, 自己用T4 Ligase做TA连接，也失败了。 |
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r*****m
发帖数: 231 | 11 把需要的位点设计在PCR引物的两端，PCR后用酶切然后连上vector。你的Lenti vector
应该至少有7，8kb吧，连个4kb的一般不会出问题。一般人做PCR cloning都是这么做的
，做不出来的才用TOPO。但你是TOPO都做不出来，就不知道为什么了。。。检查下你的
Taq是不是有问题吧。。。 |
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p******i
发帖数: 1092 | 12 查你用的載體/系統的MANUAL，裡面應該寫了
我以前用過一個什麼shRna的KIT，裡面要求加P；載體是KIT提供的，我忘記了是不是2個不同的酶切位點
引物5'带磷酸基需要另外加錢
而且de-salt quality的primer貌似還不能加P，需要高純度的primer，還要加錢
你問的那個人難道是要給LAB省錢？ |
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b********9
发帖数: 1061 | 13 最近一直在做cloning,一个3Kb, 一个2Kb，一个8Kb，连在一起，酶切为点：pstI,
HindIII, and NotI 怎么连也连不上，已经做了2个月了，哪位大虾帮帮忙？
3Kb: pstI and Not1
2Kb: notI and HindIII
8Kb: PstI and Hind III.
多谢。 |
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h**********r
发帖数: 671 | 14 以前有些paper做这个的，多个基因的表达，现在我也懒得找了。
另外比较简单的方法，分别把a,b基因克隆在pET21b上，再做一次PCR得到连同启动子，
a基因和terminator，再酶切连接到b基因的表达质粒上。最终a,b都有自己的T7
promoter,都受IPTG诱导。当然诱导程度不一定相同。
这样你就不纠结了。 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 15 DNA quality和你用的antibiotics没什么必然联系吧。Chloramphenicol用酒精溶没什
么错。
你的质粒是怎么提的？DNA quality不是光看OD就行了啊。你做过限制酶切然后跑胶看
么？你送去测序的质粒浓度是多少？太浓或者太稀都可能测不好，质粒测序的模板用量
在200-500ng之间结果最好。 |
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h******g
发帖数: 1521 | 16 做酶切确定是那个质粒，有的时候质粒污染不是你做的那个，sequencing primer自然
粘不上。 |
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e****s
发帖数: 1125 | 17 有没有做digestion test?
同时做一下single 和double digestion test,看看酶切位点对不对，Size对不对。 |
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R*****w
发帖数: 447 | 18 最大的可能性是质粒有问题。
不愿测序你可以酶切鉴定一下这个质粒是否有问题啊,
还有，你如果用提取的质粒做模板一定要稀释 >10^3
"不过这次留了个神，跑胶以后加样孔里有很多东西没跑进胶里去的样子"好像你提的质
粒都有问题。如果这些东西有你要的质粒，那你更应该稀释 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 19 酶切鉴定过了
E.coli来源的那一半和预期相符
Origin X的那一半就不相符
所以觉得质粒实际的序列和我们手上的序列不一样
另外我还有不加DNA polymerase的control
跑胶看是干干净净的，加样孔里什么都没有 |
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s******y
发帖数: 28562 | 20 从别人那里要来的质粒序列常常是不可信的。
因为不是每个实验室都很仔细检查他们的序列的。我有一次用了一个大牛实验室
给我的特殊质粒来表达蛋白，表达没有问题，但是后来我想往质粒序列里面塞
一些自己设计的东西，但是发现酶切出来的片断和图里标示的根本就是两码事。
后来索性测了一下序列，发现质粒的真实序列和他们网上写的序列差的不是一点
两点。
我建议你用E.coli来源的那部分的序列设计一个primer 往x 细菌
的序列里面测。看看连进去的到底是什么序列。 |
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g*****y
发帖数: 6325 | 21 是的，酶切后可以直接加phosphatase , 1小时后pcr 纯化。 |
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A*******e
发帖数: 284 | 22 我大约在200ul体系里面加了几十ug的质粒，按理不算多了。
我也这么想的，在中间克隆一个2-3kb的片断进去，再利用分子量的差异回收。理论上
可行，但实际操作上还有困难，因为没有切开的质粒电泳是不按线性质粒规律的，跑得
要快一点，说不定也就赶上切开的质粒了 |
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s******y
发帖数: 28562 | 23 I think the empty plasmid from your negative control cells are actually due
to self-ligation.
You may need to treat your cutted plasmid with Alkaline Phosphatase for 5~10
minutes right after digestion and then recover the cutted produt on agarose
. |
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m*********7
发帖数: 5207 | 24 In principle, two different sticky ends should not self ligate.
in reality, it happens all the time!
I still don't understand why after so many years, and I keep using
phosphatase under that circumstances. |
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s********n
发帖数: 2939 | 25 以前只是做克隆，怎么折腾总能出要的东东。但现在做库的话就需要十分小心，我的制
备的vector几乎没有background，但链接效率不高，最终只能拿到1E7/ug vector。希
望能介绍一些提高链接效率的方法。 |
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n***e
发帖数: 180 | 26 回收试一下fermentas的glass beads based DNA purification，大概回收率在8成左右
，qiagen的应该在5成以下 |
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d*********n
发帖数: 10 | 27 强烈建议用 MO BIO Laboratories, Inc的UltraClean DNA purification Kit (Cat #
= 12100-300). 自从我摒弃QIAGEN的Kit,改用MO BIO的Kit以后，胶回收片段的回收率
一直很高很稳定(很强大)。我们实验室现在都在用这个KIT.
GOOD LUCK! |
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s********n
发帖数: 2939 | 28 你建议的这个kit不是spin column的，这个公司的spin column的产品如何？
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C*******e
发帖数: 4348 | 29 我推荐的ZymoResearch的是spin column |
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A*******e
发帖数: 284 | 30 我已经定到了这个公司的kit，正想试试，谢谢啦！
另外请问用过他们的plasmid kit吗？ mini的或max的，好用吗？
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n***w
发帖数: 2405 | 32 最近做克隆，2.4kb的片段已经出来了，现在要做的就是加酶切位点，然后插到vector
里去。但是跑了几次胶，结果不算理想，想进一步optimize，不太清楚怎么做。。。
见图。。。
两个引物的Tm分别是63.8和63.3。
我第一次PCR的条件是94度3min, 94度30s, 65度45s, 72度60s,72度5min，35个循环。
结果见图1。隐约可以在2.5kb左右见到带，但是很faint。曝光2s。
我第二次PCR的条件是94度3min，94度30s, 66度30s, 72度30s，72度5min，仍然是35个
循环。结果见图2，比第一个是要好多了。貌似有些拖尾。。。
我第三次PCR的条件是94度4min, 94度30s, 66度40s，72度40，72度5min, 35个循环。
结果见图3。目的带是强了不少，但是有些弥散，还有些杂带。
我觉得还需要进一步去优化条件。
请大家给我出出主意。。。
谢谢。。
ps，第二次和第三次的引物比第一次多加了0.1ul。。。模版的浓度大概30ng/ul，上了
1ul。
谢谢。 |
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p****p
发帖数: 3360 | 33 做克隆的中心思想是一个就够了。PCR片断做克隆的中心思想是别引进突变了。
综合这两点，你应该用第二个条件，加DNA模板稍微多些，run PCR的循环数减少到30或
以下。加全部样品酶切，纯化。一个克隆就够了。
vector |
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s******r
发帖数: 2876 | 34 试试hot start, 加touchdown，有时候有奇效。
最近做克隆，2.4kb的片段已经出来了，现在要做的就是加酶切位点，然后插到vector
里去。但是跑了几次胶，结果不算理想，想进一步optimize，不太清楚怎么做。。。
见图。。。
两个引物的Tm分别是63.8和63.3。
我第一次PCR的条件是94度3min, 94度30s, 65度45s, 72度60s,72度5min，35个循环。
结果见图1。隐约可以在2.5kb左右见到带，但是很faint。曝光2s。
我第二次PCR的条件是94度3min，94度30s, 66度30s, 72度30s，72度5min，仍然是35个
循环。结果见图2，比第一个是要好多了。貌似有些拖尾。。。
我第三次PCR的条件是94度4min, 94度30s, 66度40s，72度40，72度5min, 35个循环。
结果见图3。目的带是强了不少，但是有些弥散，还有些杂带。
我觉得还需要进一步去优化条件。
请大家给我出出主意。。。
谢谢。。
ps，第二次和第三次的引物比第一次多加了0.1ul。。。模版的浓度大概30ng/ul，上了
1ul。
谢谢 |
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b****u
发帖数: 903 | 35 ME too, 最近亚克隆都邪门了，链接的板上一个不长或者很少几个，而vector自连的长
了几十个，用的是neb的ecor1和sal1双酶切。 |
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S*******m
发帖数: 34 | 36 我买过sigma和open biosystem的 shRNAs。 Sigma 的从来没有失败过， 而open
biosystem有可能不work。 我建议你从简单的步骤开始查起，先酶切看看你得到的克隆
对不对。省时间省力气。如果你拿到的是菌株，多挑几个克隆试试。 |
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m******5
发帖数: 1383 | 37 PCR screen的都是positive的……
噢，送出去测序了，另外只好重新来了，刚到一个实验室，感觉所有系统都还不熟悉。
以前这种连接三天就搞定了 |
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s********n
发帖数: 2939 | 39 可能个人偏好不同，PCR优点在于通量高，而且很大提高正确率，自从以前做的一个低
效率克隆（1/20）后我就都改用PCR screening了。 |
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M****m
发帖数: 2142 | 40 3。5 kb呀，胶浓度大不是分不开大片段了么，要是小于200的好像浓度大对，哪里可以
找到酶切位点呢，网上只有MCS的那些 没有其他部位的sequence。。。 |
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m*********7
发帖数: 111 | 41 Roche Expand Long Template PCR system. 但23kb太长了，利用酶切位点把多个PCR
fragment 连起来比较靠谱 |
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x****e
发帖数: 53 | 43 噢,血漿（or 血清）裏有很多非特異蛋白酶嗎? 序列裏加點P 吧 |
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x****e
发帖数: 53 | 44 噢， 孤陋寡聞了， 能給幾篇血漿内非特異蛋白酶的文獻嗎？
序列裏加 Proline 應該有幫助吧 |
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t****p
发帖数: 1504 | 47 不溶的话怎么整都不行。95度难道不会导致DNA变性？下面还怎么做酶切啥的？ |
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c******r
发帖数: 3778 | 48 。。。DNA变性？DNA变性又不影响酶切，也不影响PCR，只要不断就可以啊。反正一降
温不就重新anneal了吗？如果担心可以慢慢降温啊，比如放60度10分钟。不要95度然后
直接放冰上，那个会影响DNA的annealing。
不过加热好不好使我真的没直接试验过 |
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s********n
发帖数: 2939 | 49 Overlap pcr和restriction enzymes digestion（可用酶切位点不在识别位点内的RE,
如BsaI）都可以，最简单就是直接合成基因。 |
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