f*****n 发帖数: 499 | 1 比如一个384孔板,一个sample至少要6个孔(3 replicates for target gene and 3
for gapdh control)
这样最多能同时做64个样本
但如果超过64个样本怎么办呢?那就只能分两批做,可是这样会有batch effect,就是
每一“锅”的qpcr都是不太一样的,两“锅”data直接拼到一起比较,是不是有问题?
有没有啥好办法remove batch effect呢 |
a******r 发帖数: 786 | 2 我用一种方法需要两个house keeping gene,先求geomean,再跟 target gene 算。这
样降低一点housekeeping gene bias, 理论上减少一些你说的。
当然也有人减少replicate 一口气来两张板的也有
总的来说384对眼睛不好 |
j****n 发帖数: 3370 | 3 这么多样品
上rna-seq得了
【在 f*****n 的大作中提到】 : 比如一个384孔板,一个sample至少要6个孔(3 replicates for target gene and 3 : for gapdh control) : 这样最多能同时做64个样本 : 但如果超过64个样本怎么办呢?那就只能分两批做,可是这样会有batch effect,就是 : 每一“锅”的qpcr都是不太一样的,两“锅”data直接拼到一起比较,是不是有问题? : 有没有啥好办法remove batch effect呢
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S**********e 发帖数: 620 | 4 有一种枪叫做分装枪,充电的,2个复孔误差很小,当然这个只是增加速度,手不菜一
般误差都没有那么夸张。
每一锅其实误差不应该很大,PCR机器比人的手稳定太多了。当然你比较的时候要那该
基因内参的百分比来做比较。
还有一个,误差大一般就是表达量超出范围了,不可靠。
【在 f*****n 的大作中提到】 : 比如一个384孔板,一个sample至少要6个孔(3 replicates for target gene and 3 : for gapdh control) : 这样最多能同时做64个样本 : 但如果超过64个样本怎么办呢?那就只能分两批做,可是这样会有batch effect,就是 : 每一“锅”的qpcr都是不太一样的,两“锅”data直接拼到一起比较,是不是有问题? : 有没有啥好办法remove batch effect呢
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x*****e 发帖数: 309 | 5 batch effect没想象的那么大吧?如果真的和hcy的batch effect那么大,这实验没法
做或者多优化多练习吧。
【在 f*****n 的大作中提到】 : 比如一个384孔板,一个sample至少要6个孔(3 replicates for target gene and 3 : for gapdh control) : 这样最多能同时做64个样本 : 但如果超过64个样本怎么办呢?那就只能分两批做,可是这样会有batch effect,就是 : 每一“锅”的qpcr都是不太一样的,两“锅”data直接拼到一起比较,是不是有问题? : 有没有啥好办法remove batch effect呢
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a******r 发帖数: 786 | 6 384 孔板 感觉做多了真的会瞎眼。error 也比较大,第一个loading 可能和最后一个
差几个小时。
384 只能筛一筛,重复的话还得选择96
【在 x*****e 的大作中提到】 : batch effect没想象的那么大吧?如果真的和hcy的batch effect那么大,这实验没法 : 做或者多优化多练习吧。
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l*******i 发帖数: 153 | 7 一个小时内加完的话,基本没差异。我一个上午3个小时,能加两块满板(包括准备mix
),跑下来,一个板子内的replicate之间差异在0.1-0.3 个 CT值,两个板子之间也基
本不超过0.5个CT值(除了表达量极低的)。
【在 a******r 的大作中提到】 : 384 孔板 感觉做多了真的会瞎眼。error 也比较大,第一个loading 可能和最后一个 : 差几个小时。 : 384 只能筛一筛,重复的话还得选择96
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a******r 发帖数: 786 | 8 384 个孔,每个孔最起码得加mix 跟样品,就是768 下,平均5秒一下。这还不算拿样
品点抢头的时间
你这速度也是绝了
mix
【在 l*******i 的大作中提到】 : 一个小时内加完的话,基本没差异。我一个上午3个小时,能加两块满板(包括准备mix : ),跑下来,一个板子内的replicate之间差异在0.1-0.3 个 CT值,两个板子之间也基 : 本不超过0.5个CT值(除了表达量极低的)。
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S**********e 发帖数: 620 | 9 你这也够慢的,我有很多小trick,至今没出过问题,速度绝对超群,而且不累
【在 a******r 的大作中提到】 : 384 个孔,每个孔最起码得加mix 跟样品,就是768 下,平均5秒一下。这还不算拿样 : 品点抢头的时间 : 你这速度也是绝了 : : mix
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S**********e 发帖数: 620 | 10 不会有什么差别,做出来的结果要可信,那别人重复的话那就是不一样的机器不一样的
引物不一样的样品。batch要是有区别,那别人肯定重复不出来。
【在 x*****e 的大作中提到】 : batch effect没想象的那么大吧?如果真的和hcy的batch effect那么大,这实验没法 : 做或者多优化多练习吧。
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y****6 发帖数: 196 | |
Z******5 发帖数: 435 | 12 以前用过exiqon的miRNA qPCR array, 两块板,700多个孔,数据质量实在不咋地。算
一下价格,真不如直接上RNA-seq |
x*****e 发帖数: 309 | 13 对,一个实验自己做都不能控制好batch effect,指望别人能做好就更难了.不过Kary
Mullis好像是个例外,公司给配了个手稳的助手才搞定PCR, 希望hcy也是个例外.
【在 S**********e 的大作中提到】 : 不会有什么差别,做出来的结果要可信,那别人重复的话那就是不一样的机器不一样的 : 引物不一样的样品。batch要是有区别,那别人肯定重复不出来。
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