b*****n
发帖数: 1841 | 1 假设Cas9已经在DNA上切了一刀了，那么究竟是添加或者去除1，2,3个碱基是完全随机
的吗？如果是这样，不是意味着有三分之一的可能性不会移码突变？
如果以上猜测正确，能否表达多个sgRNA在一个基因上不同的位置编辑从而提高移码突
变的可能性？ |
m*********D
发帖数: 1727 | 2 我的理解是随机的。但有文章说，80%的概率是DSB后，没有indel,直接连回去。我自己
的结果是一半直接连，没有indel.
两个DSB是可以的。这样是把两个DSB之间的那端delete了。我就是这么干的。但多一个
guide, 就多了off-target的担忧。 |
b*****n
发帖数: 1841 | 3 如果是直接连回去那么你怎么会知道它曾经切过一刀呢？
如果不能产生突变的概率是这么高的话，在体内没有药物筛选环境下进行所谓的基因切
除就是纸上谈兵了。
【在 m*********D 的大作中提到】
: 我的理解是随机的。但有文章说，80%的概率是DSB后，没有indel,直接连回去。我自己
: 的结果是一半直接连，没有indel.
: 两个DSB是可以的。这样是把两个DSB之间的那端delete了。我就是这么干的。但多一个
: guide, 就多了off-target的担忧。
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x****6
发帖数: 4339 | 4 如果同一个细胞内存在携带同源片段的ssDNA,按照这个模板进行的同源重组修复会有一
点比例 |
m*********D
发帖数: 1727 | 5 我用了两个DSB，有没有indel自然一目了然了。另外，只作indel,直接连回去的，只要
还有guide/cas9,往往会被再切，一直到guide或PAM出现问题。
【在 b*****n 的大作中提到】
: 如果是直接连回去那么你怎么会知道它曾经切过一刀呢？
: 如果不能产生突变的概率是这么高的话，在体内没有药物筛选环境下进行所谓的基因切
: 除就是纸上谈兵了。
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b*****n
发帖数: 1841 | 6 嗯，你后面那句话给了我足够信息，多谢！
【在 m*********D 的大作中提到】
: 我用了两个DSB，有没有indel自然一目了然了。另外，只作indel,直接连回去的，只要
: 还有guide/cas9,往往会被再切，一直到guide或PAM出现问题。
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I****p
发帖数: 101 | 7 你这个观察（会被再切，一直到guide或PAM出现问题）确实很有意思。我想请教一下：
我们得到一共40几个转基因的很小个体（两个基因），都经过抗性筛选，但是测序后没
有一个有Indel。如果让这些小个体长大，有没有可能Cas9 表达量加大，最终出现
Indel?
起初怀疑，转基因插入到基因沉默区域，但是抗性基因却起作用，所以是其它原因了。
是向别人要来的载体，他们发文章说60-85% 的编辑频率，不知道要不要用Cas9 抗体看
看蛋白有没有表达。去做些无谓的Trouble Shooting真费劲，也许干脆换一个载体。
谢谢！
【在 m*********D 的大作中提到】
: 我用了两个DSB，有没有indel自然一目了然了。另外，只作indel,直接连回去的，只要
: 还有guide/cas9,往往会被再切，一直到guide或PAM出现问题。
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