L*********g
发帖数: 3001 | 1 问一个蛋白磷酸化的问题
要从6孔板里提蛋白，检测磷酸化，由于细胞密度比较低，能否直接把大约200 ul的2 X
laemmli buffer加到孔里，迅速刮下来，然后煮5分钟？整个过程很快，从加buffer到
放到heat block上，在1分钟内完成。
请问，这样做可以么？会不会导致磷酸化消失？
如果这样做不好，还有别的什么办法？
谢谢。 |
f*******d
发帖数: 92 | 2 这个样做其实对于磷酸化是最好了，这样可以迅速denature所有的蛋白，包括
phosphotase, 从而最大程度上preserve post-translational modification. 只是我
还是会在laemmli buffer里加上protease inhibitors, 煮完之后sonicate, spin down
, bradford，load supernatant. |
d****i
发帖数: 2346 | 3
X
这个办法我试过，但不是做磷酸化。可能我操作慢，感觉把6个well全部在1min内完成
很困难，很紧张。要不你放在35mm的小dish分别操作？
【在 L*********g 的大作中提到】
: 问一个蛋白磷酸化的问题
: 要从6孔板里提蛋白，检测磷酸化，由于细胞密度比较低，能否直接把大约200 ul的2 X
: laemmli buffer加到孔里，迅速刮下来，然后煮5分钟？整个过程很快，从加buffer到
: 放到heat block上，在1分钟内完成。
: 请问，这样做可以么？会不会导致磷酸化消失？
: 如果这样做不好，还有别的什么办法？
: 谢谢。
|
v**********m
发帖数: 5516 | 4 培养基洗洗干净，再加SDS buffer 当然没有问题，体积要调整好。
X
【在 L*********g 的大作中提到】
: 问一个蛋白磷酸化的问题
: 要从6孔板里提蛋白，检测磷酸化，由于细胞密度比较低，能否直接把大约200 ul的2 X
: laemmli buffer加到孔里，迅速刮下来，然后煮5分钟？整个过程很快，从加buffer到
: 放到heat block上，在1分钟内完成。
: 请问，这样做可以么？会不会导致磷酸化消失？
: 如果这样做不好，还有别的什么办法？
: 谢谢。
|
L*********g
发帖数: 3001 | 5 我上次做只有2个well，做完第一个再做第二个，每个不超过一分钟。
以后样品多的话就需要用35mm dish了。
【在 d****i 的大作中提到】
:
: X
: 这个办法我试过，但不是做磷酸化。可能我操作慢，感觉把6个well全部在1min内完成
: 很困难，很紧张。要不你放在35mm的小dish分别操作？
|
L*********g
发帖数: 3001 | 6 第一次做没洗，主要想节约时间。以后打算还是洗一洗。
洗的期间不会去磷酸化吧？
【在 v**********m 的大作中提到】
: 培养基洗洗干净，再加SDS buffer 当然没有问题，体积要调整好。
:
: X
|
e****s
发帖数: 1125 | 7 我们一般在PBS里面放点Phosphatase 和Protease的inhibitors，再洗。
【在 L*********g 的大作中提到】
: 第一次做没洗，主要想节约时间。以后打算还是洗一洗。
: 洗的期间不会去磷酸化吧？
|
r******k
发帖数: 446 | 8 我晕 这么讲究。。。 我有的时候用有phos-stop和 protease inhibitor的pbs洗，有
的时候就是用普通的ice cold pbs洗。 然后加lysis buffer，还超声。。。。。。。
。。 感觉要是有的还是有 要是没有怎么都没有。。。嘻嘻
而且楼主做磷酸化不用BCA定量吗？ 其实我觉得磷酸化没那么容易就去掉，不然大家干
嘛还要有lambada phosphotase去磷酸化做control呢 |
J*****y
发帖数: 179 | 9 问个相关的：板上有哪位用flow cytometry 看胞内蛋白的磷酸化的？效果如何？有没
有特别需要注意的地方？ |
s******y
发帖数: 28562 | 10 对于绝大部分情况都是可以的了。
唯一要注意的一点是要把细胞培养液完全去除。
X
【在 L*********g 的大作中提到】
: 问一个蛋白磷酸化的问题
: 要从6孔板里提蛋白，检测磷酸化，由于细胞密度比较低，能否直接把大约200 ul的2 X
: laemmli buffer加到孔里，迅速刮下来，然后煮5分钟？整个过程很快，从加buffer到
: 放到heat block上，在1分钟内完成。
: 请问，这样做可以么？会不会导致磷酸化消失？
: 如果这样做不好，还有别的什么办法？
: 谢谢。
|
|
|
r******k
发帖数: 446 | 11 用facs看磷酸化 主要先看你这抗体好不好用。 如果好用 我觉得还是比western好 起
码省时间。但是如果你的蛋白的磷酸化跟cell adhension什么的相关 那就不好了 你把
细胞一typsinize signaling就会改变。
【在 J*****y 的大作中提到】
: 问个相关的：板上有哪位用flow cytometry 看胞内蛋白的磷酸化的？效果如何？有没
: 有特别需要注意的地方？
|
r******k
发帖数: 446 | 12 LZ这个方法 难道直接往loading buffer里面加 protease inhibitor和 phospho
inhibitor？
【在 s******y 的大作中提到】
: 对于绝大部分情况都是可以的了。
: 唯一要注意的一点是要把细胞培养液完全去除。
:
: X
|
J*****y
发帖数: 179 | 13 谢谢，我主要是看在刺激条件下各种B 细胞亚型的反应，特别是我的ko b细胞，上
western细胞数根本不够。昨天从bd订了两个，试一把
【在 r******k 的大作中提到】
: 用facs看磷酸化 主要先看你这抗体好不好用。 如果好用 我觉得还是比western好 起
: 码省时间。但是如果你的蛋白的磷酸化跟cell adhension什么的相关 那就不好了 你把
: 细胞一typsinize signaling就会改变。
|
r******k
发帖数: 446 | 14 是悬浮细胞的话 更没有问题了。
【在 J*****y 的大作中提到】
: 谢谢，我主要是看在刺激条件下各种B 细胞亚型的反应，特别是我的ko b细胞，上
: western细胞数根本不够。昨天从bd订了两个，试一把
|
K******5
发帖数: 10 | 15 楼主细胞少，可试试用spin column法提蛋白，可得到浓度很高的蛋白，体积可以小到
10-20ul，一两分钟就能搞定。Phosphatase inhibitor 一定要用。 |
