s********8
发帖数: 619 | 1 有人有经验吗?
手上的课题需要从极少量的FACSed细胞中提取RNA做RNAseq.现在一次sorting只能拿到
差不多3000个细胞,运气好的话应该一次可以拿到6000个细胞.
本来打算直接sort到Trizol里面冻起来,这样多sort几次,攒在一起提RNA.可是FACS
facility又不让我用Trizol,所以现在是sort到 RNaqueous micro kit 的lysis buffer
里.提完了RNA一测,几乎啥也测不出来,因为大概也只有十几个ng的样子.
所以我是不是应该考虑用commercial kit来做个amplification?求大牛推荐kit或者好
的方法! | s******s
发帖数: 13035 | 2 哺乳动物细胞么？3000个足够了。
我以前用的是roche 的magna pure kit，你看看facility有没有这玩意儿。
buffer
【在 s********8 的大作中提到】
: 有人有经验吗?
: 手上的课题需要从极少量的FACSed细胞中提取RNA做RNAseq.现在一次sorting只能拿到
: 差不多3000个细胞,运气好的话应该一次可以拿到6000个细胞.
: 本来打算直接sort到Trizol里面冻起来,这样多sort几次,攒在一起提RNA.可是FACS
: facility又不让我用Trizol,所以现在是sort到 RNaqueous micro kit 的lysis buffer
: 里.提完了RNA一测,几乎啥也测不出来,因为大概也只有十几个ng的样子.
: 所以我是不是应该考虑用commercial kit来做个amplification?求大牛推荐kit或者好
: 的方法!
| D*a
发帖数: 6830 | 3 单细胞的都能做了，3000个不少了。kit不熟，直接问做rna seq的地方吧，如果他们不
知道，就问问他们跟谁合作做过这种然后再去问那个实验室。别自己闷头瞎搞。 | c*********r
发帖数: 1312 | 4 理论上够了，关键看你用什么试剂盒来做library。和有经验的sequencing facility交
流交流。
测低浓度RNA不要用nanodrop，用Qubit HS(High Sensitivity)或者bioanalyzer。
我去年暑假做的，500 ng可以作常规的RNA-seq，而且当时担心Ribo-Zero那一步会不会
有很多损失。实际上现在需要的RNA量可以比这个低很多。
单细胞的测序也开始流行，就是成本高。。。
buffer
【在 s********8 的大作中提到】
: 有人有经验吗?
: 手上的课题需要从极少量的FACSed细胞中提取RNA做RNAseq.现在一次sorting只能拿到
: 差不多3000个细胞,运气好的话应该一次可以拿到6000个细胞.
: 本来打算直接sort到Trizol里面冻起来,这样多sort几次,攒在一起提RNA.可是FACS
: facility又不让我用Trizol,所以现在是sort到 RNaqueous micro kit 的lysis buffer
: 里.提完了RNA一测,几乎啥也测不出来,因为大概也只有十几个ng的样子.
: 所以我是不是应该考虑用commercial kit来做个amplification?求大牛推荐kit或者好
: 的方法!
| a*******g
发帖数: 33 | 5 样品在lysis buffer中可以冻起来，等收集几次之后pool在一起提取，不用扩增的话，
100ng就可以做sequence了。如果你需要测的样品比较多，嫌麻烦的话，10ng可以扩增
的。总体上，人们倾向不扩增。提起少量rna，有life tech的picropure和qigen的
rneasy micro kit,测浓度用life tech的quit,质量用aligent的picro chip。 | s********8
发帖数: 619 | 6 谢谢楼上各位的回复！我们的sequencing facility好像没有amplification的经验，他
们说要200ng RNA。我再去问问吧。
我也不太想扩增，尽量多做几次FACS，冻起来一起提吧。 | G******n
发帖数: 289 | 7 少量肯定没问题，就像你们core说的，200ng就可以做了。200ng不用做太多的primer
specific amp，普通的20cycle AMP不影响结果。我是说你的两组或者多组sample都要
有同样的protocol |
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