y*****u
发帖数: 31 | 1 近必须要用Trizol提取组织里的gDNA.第一次跟着Trizol公司的protocol走浓度很低质
量很差。第二次改进了方法测出浓度较高，质量很差，然后用NACL和酒精简单洗了后浓
度低极了，质量好了。现在我采取了一个改进的TRIZOL提DNA方法，但是由于方法说明
比较模糊，所以试着做了下，DNA浓度低，质量差。
这个新方法:移除TRIZOL-CHLOROFORM分层出的上清RNA后，在有机层中加入1/10体积的
10% SDS和1/2体积的5M NACL.混匀后离心12,000rpm.这样得出肉眼可见的三层（上清，
中间一层白色物质，下层的粉色物质）。根据别人发表的PAPER上的说明是移用上清，
所以我就抽取上清加入95%冷酒精，-80°C 15分钟后高速离心沉淀。后续就是和原始的
TRIZOL protocol一样的的柠檬酸钠和75%酒精沉淀清洗，结果没有看到DNA白色沉淀，
测试后发现DNA质量差，浓度很低很低低低。我就用水做BLANK,测了下我保留下来的中
间一层白色物质（一开始以为上清是DNA),结果发现DNA浓度很高，质量也行。我怀疑
DNA根本就不在上清里面，而是在中... 阅读全帖 |
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b*****n
发帖数: 1841 | 2 上网查了一些内容，发现相当一部分人推荐用DNase处理样品。
我想能否在Trizol抽提中加chloroform离心后的水相中加DNase，然后再加0.5ml
Trizol杀灭和去除DNase。
不确定水相中的成分，DNase的活性如何，再用少量Trizol抽提是否能把DNase去除干净。
或者用isopropanol沉淀后再加Dnase处理，再用Trizol去除DNase？这样沉淀的步骤对
RNA的损失比较大。
请大家发表一下意见。 |
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w******e
发帖数: 1187 | 3 土人第一次做，全盘follow trizol的protocol。为省reagent用了100mg tissue
per ml trizol。发现以下问题，请达人指点：
1. chloroform extraction后的precipitation，为什么用isopropanol？室温
incubate也让我很困惑。。。
2. 做了两次，第一次是heart，拿到RNA很顺利，测OD时发现：260 peak偏向270；
230附近有极高的峰。看来chloroform和precipitate后wash的步骤都不太effective？
3. 第二次做liver，搞到巨多RNA，很oily，dry了之后pellet死活不溶，试了
60oC加热，加大volume，最后还是有很多不溶。是不是trizol用少了？
4. 用了hand held homogenizer和pestle+mortar两种tissue homogenization
methods，run了urea agarose gel（顺便请问大家都用什么denaturing gel），
18S:28S rRNA大约1：1，很困惑degra |
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f*********r
发帖数: 1233 | 4 对，我是今年才开始用的。因为以前一直用他们trizol，所以他们经常给我们发新产品
广告和免费试用小包装。试了一下，很好用。对于大规模处理样品，每次几十上百个样
品，这个试剂非常实用。好处如下：
1）一步完成，简便快捷。
2）对样品要求不高，适用范围广。rna质量有保证，比trizol只高不低。从大块组织到
少量细胞，都行。不象过柱，纯是纯，但是对浓度、液体量等都限制很严。
3）跟trizol兼容。
4）不贵
5）对实验人员的技巧要求甚低。 |
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v***a
发帖数: 1242 | 5 谢谢！呵呵，查了一下，果然还要便宜点。比如100 mg tissue 消耗 1 ml TRIzol/
RNAzol，100 ml的TRIzol卖 $ 145，而100 ml的RNAzol卖 $ 134. |
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h*******o
发帖数: 4884 | 6 trizol做RNA和DNA还行，protein那个做出来，不加SDS根本没法溶，加了SDS 跑出来的
胶跟鬼画符一样
DNA 我以前用trizol做没什么问题
就是干的时候不能太久，如果容不了可以加NaOH 去溶 |
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v***a
发帖数: 1242 | 7 第一次做siRNA，想请教大家，用Trizol提取了RNA后，在进入RT-PCR之前有什么
注意事项吗？比如说像overexpression后要用Dnase I处理（感谢上次艳阳天mm的帮助
）。谢谢啊！ |
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h****g
发帖数: 439 | 8 因为用Trizol或者说任何方法提RNA，都不能保证没有genomic DNA的contamination。所以要在RT前做一下 DNase I treatment
另外一个方法是，设计的引物要跨Intron，这样也可以避免genomic DNA 的contamination 的干扰.
PCR
DNA |
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a***e
发帖数: 1010 | 9 I agree that it may be not that important to treat RNA sample with DNaseI
during the RNA purification process in the original question. However, it is
better to maintain a "good habit" to do so.
There are several reasons for this:
(1) it doesn't add many extra work. DNaseI treatment is very simple and fast
. Qiagen has on-column DNaseI digestion kit. Or an extra TRIzol purification
step only adds one more hour.
(2) if the experiments include transfection of plasmid to overexpress some
genes or s |
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T**********t
发帖数: 1604 | 10 别的我不知道。
不过ethanol precipitation的recovery其实在室温下比在低温下更好。温度越低，
recovery越差。很多protocol建议低温，其实是出于degradation的考虑。有可能这个
trizol kit里加了很多酶抑制剂，所以不怕degradation，就可以室温操作了。
isopropanol的沉淀效率比ethanol高，所以需要的用量比ethanol少，适合用于浓度比
较低的核酸沉淀。但是isopropanol比ethanol难挥发，真空干燥用的时间更长，得到的
pellet也不如ethanol precipitation的pellet贴壁贴得牢。
至于你的chloroform wash不够effective的问题，也有可能是你吸取aqueous phase的
时候太贪心，想尽量把上层吸干净，结果反而夹带了一点phenol进来。我经常犯这种错
误，最后不得不再做一次chloroform wash，得不偿失。。。 |
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f*********r
发帖数: 1233 | 11 我不直接回答你的问题，只是提供一个貌似更好的、而且可行的方案。
与其用trizol，加什么氯仿、异丙醇，最后是乙醇这么多步骤，不如用RNAzol一步完成
。pipette的时候，不用担心多吸会有下层液体的污染。因为rnazol根本没有液体分层。
不管用那种试剂，你这种从活体组织提取rna的情况，根本用不着100mg。尤其象肝脏。
有两三粒芝麻大小的组织就完全可以了。当然，还是用1ml试剂比较稳妥。
另外，在加异丙醇（或者别的醇）沉淀rna的时候，不一定按照说明那样离心。可以采
取小一些转速。这样出来的pellet比较松。用酒精洗就会洗得干净。最后溶解的时候也
更容易。不用担心低转速会导致低收获量。你有足够的样品，不存在收获量低的问题。
只要动作快，不用担心常温、低温。比如用rnazol，从匀浆化到形成rna沉淀pellet，
不超过20分钟。从头至尾都有保护：试剂可以保护溶解状态rna不受降解，沉淀状态的
rna也不容易降解。
为了提高匀浆化效率，可采用sonication。10秒钟可以完全打散任何组织。 |
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y****m
发帖数: 37 | 12 I recommend you to read Cold Spring Harb Protocol by Rio DC, Ares M Jr,
Hannon GJ, Nilsen TW.
1. less volumn required
2. after isopropanol precipitation, there are normally still lots of crap in
sample. I normally use water plus 0.25% SDS to dissolve pellet, then phenol
extract again, Ethenal precipitate the sample.
3. completely dried RNA is normally very hard to disovle, try to avoid that.
4. after sanp freeze, before thraw in trizol, you could grind it with liquid
N2 first, then disolve with |
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h*******o
发帖数: 4884 | 13 我们实验室都是用得bead homogenizer来打碎组织的
根据组织不同用不同材料和大小的beads,和tissue一起放在trizol里面打 |
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c******r
发帖数: 3778 | 14 trizol的意思就是可以分离dna，rna，和protein。具体步骤看说明书 |
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y*****u
发帖数: 31 | 16 因为要从同一组织同时提RNA和DNA.而且组织运来时已经在TRIZOL里面了。 |
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y*****u
发帖数: 31 | 17 现在所有的样品都已经在TRIZOL里面寄来的。无法使用Qiagen家的KIT了，是否有生化
方面的专家能帮我分析一下我目前打算采取的步骤是否合理呢？ |
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a***e
发帖数: 1010 | 18 TRIzol
上层: RNA 或者质粒DNA
中层: gDNA
下层: protein |
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c********b
发帖数: 363 | 19 只是觉得可行，但是没有试过，你可以考虑下。
在你的trizol：chloroform分离移去了RNA上清后，应该接着加碱性的Phenol（和剩余
提及1:1），然后再离心取上清，加酒精，然后不要用沉淀法而是用一个提gDNA的柱子
过柱，清洗，回收。
good luck |
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Z******5
发帖数: 435 | 20 曾经尝试用Trizol同时分离过cell line的RNA和蛋白质，感觉根本不靠谱。 后来还是
平行做两盘，一盘只提RNA，一盘做蛋白，方便快捷又保险。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 21 你trizol, chloroform污染过的水相，DNase不太可能有活性。
反正我都是用kit的。。。
净。 |
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e********c
发帖数: 30 | 22 RT。细胞是从流式sorting下来的，只有几千个细胞。请问用trizol直接提取RNA，然后
RT-qPCR检测特定基因的敲出效率，RNA够用吗？
有没有人这么做过呢？多谢！ |
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M*****e
发帖数: 279 | 24 我的办法可能能帮你解决问题.
我曾经试过多种办法提没有降解（用Bio-Rad or Agilent Bioanalyzer测integrity or
quality (RNA Integrity Number (RIN) by Agilent or RNA Quality Index (RQI)
by Bio-Rad)，不是仅仅用Nanodrop测RNA integrity or quality）的total RNA，然后
做microarray．
1.液氮研磨：RNA quality好，可以做microarray，但是麻烦和太慢（原因你应该知道
）。
２. Glass tissue homogenizer: it didn't work for me to grind tissue in
Trizol in ice bucket with ice, although my tissue was thin and tiny.
Bioanalyzer showed RNA degradation.It's also low through-put.
3. Hand-held electr... 阅读全帖 |
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c*********d
发帖数: 9770 | 25 荒猫牛不耕微信号laoniu003005
功能介绍
好文分享
来源：荒猫之舞
作者：荒猫
中美贸易战告一段落，毫不意外地，咱们又赢了。不过与以往不同的是，这次美国也赢
了，是双赢。据报道，咱们答应了美国减少贸易逆差的要求，所以美国赢了；而因为要
减少贸易逆差，中方将大量增加自美购买商品和服务，这样可以满足咱们不断增长的消
费需求和促进高质量经济发展，所以咱们也赢了。
但让我感觉不可思议的是，这么好的事情，为什么一直不做呢？为什么要在美国政府的
逼迫下去做呢？是因为没有想到？那岂不是说那些人能力低下？是因为想到了而不做，
那岂不是证明了那些人很坏？
而且在美国高调启动贸易战之初，咱们是抱着多大的决心，宁为玉碎不为瓦全，一定要
打赢的，一定要粉碎美国人阻挡咱们大国崛起的阴谋的。当美国提出500亿的清单时，
咱们针锋相对；当美国提出1000亿的清单时，咱们继续应战；而当美国把清单的总价提
高到2000亿的时候，一夜之间，美国就不是阻挡咱们大国崛起，而是有利于咱们大国崛
起了。美国的要求原来是有利于咱们的发展，而不是遏制咱们的发展了。我恍然大悟：
原来以前的针锋相对，是用的激将法，是为了刺激美... 阅读全帖 |
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w******a
发帖数: 1527 | 26 Check this one:
Reagents
* TRIzol from Invitrogen #15596-108.
* Mini RNeasy plus kit from Qiagen #74134.
* Phase lock gel from Eppendorf #2302830.
* Keep TRIzol at 4C.
* Use RNase-free tubes and tips for all steps.
* Prepare 70% ethanol using DEPC-H2O and keep it at -20C.
RNeasy plus kit contains a genomic DNA elimination column. It can replace
the DNase I digestion step of regular RNeasy kit.
1. Add 1.2 ml TRIzol reagent to cells/tissues (5~10X 106 cells/ml or 50~100
mg ... 阅读全帖 |
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V********n
发帖数: 305 | 27 俺可当不得前辈二字
可能不行了。除非是先用Trizol提出来，然后再过KIT，好比是用KIT 纯化，这样损失
会很大。按理如果细胞量够，Trizol提不会有问题。你再琢磨一下你的Trizol
protocol吧。 |
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f*********r
发帖数: 1233 | 28 假设你说的是小鼠。一般是取胫骨和股骨。一共4根骨头的骨髓绝对不少。每根骨头提
出10^7细胞没有问题。应该比1盘10cm的细胞多。每次取完，放在pbs里冲散，计数看一
下。不应该象你说的产量那么少。可惜离普大太远，不然可以表演给你看。
用trizol提rna，不用过液氮。只要homogenize了，trizol可以有效保护rna。4度冰箱
里放个把星期没问题。
是不是因为液氮这样的低温影响了trizol，我就没有经验了。 |
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s*****a
发帖数: 59 | 29 现在我提total RNA是用trizol+turbo DNase。我一直觉得trizol提的RNA质量最好，但
是看到很多人都用column提取做qRT-PCR的total RNA。请问为什么？是因为trizol麻烦
还是怕cross-contamination？
a |
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h******y
发帖数: 351 | 30 DNA不是因为和蛋白结合着才被分开的。Trizol是酸性的，这种pH情况下DNA进入有机相
和中间相，RNA进入水相。当然如果Trizol量不够，DNA量太多的时候也会进入水相。所
以说不要省Trizol。 |
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f*********r
发帖数: 1233 | 31 那就是说，样本来源比较丰富。这就比较好办。
trizol，白色/无色，忘了哪个公司的，不好。一是保存在4度会呈凝胶状。二是离心分
层的时候，界面不清晰。
trizol，粉红色，thermo。一般。有的时候rna沉淀是胶冻状，不太容易和杂质区分。
tri-reagent，粉红色，mrc。不错。技术熟练者可提到很多rna，而且纯度可以很高，
接近于2.0。要点是，不要贪多。每个样品不要太大块组织，够30-50微克的rna就好。
以上三者缺点是提纯步骤多，时间长。
rnazol，蓝色，mrc。不错。优点是一步提纯，如果不算酒精清洗这一步，半小时内可
完成。缺点是，纯度不如前者。1.8没问题，1.9以上就很少见了。
rna柱，qiagen。很不错。优点是可以很纯，大于2.0。缺点一是贵，二是对样品中rna
的量限制得比较严。多了不好，少了也不好。
rna bee没玩过，可参照上面老兄说的。
如果你做的real-time pcr比较稳定，引物特异性敏感性好，反应条件不严格（比如退
火温度，Mg离子浓度等），就没必要选rna提纯柱。如果是新手，可以先试试rnazol。
步骤简单易掌握，价钱不贵，现 |
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j******b
发帖数: 78 | 32 you may consider to flush the bone (tibia or femur) with 1ml Trizol directly
. should be able to get enough RNA for RT, Realtime etc.
BTW, freeze shouldn't affect your RNA yield.Just make sure the samples are
at room temperatur when you start Trizol isolation. |
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O*********e
发帖数: 79 | 33 trizol
i think I used plenty
I can see the pellets floating in the TE, not oily though
I did the isolation with trizol samples from other cells, they were just
fine (nice pellets, dissolved easily in TE), so I'm thinking it's the
macrophage RNA that gives me trouble.
anybody on this board working with macrophages? |
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C*******e
发帖数: 4348 | 34 有的东西用kit做效果不好
结果还是要用trizol
trizol其实也就是加了别的东西的phenol |
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s******s
发帖数: 13035 | 35 要分离DNA和蛋白。DNA去做seq, 蛋白去做MS Spec. 大家有什么好主意？
我就想到了Trizol, 不过貌似Trizol下来的蛋白很不好溶，做Ms Spec质量
很不好。有没有什么commercial的kit? 最好column based比较容易做 |
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a***y
发帖数: 19743 | 36 和TRIzol比如何？
Promega这个kit可以用vaccum，column based
而且提取过程就基本彻底去除genomic DNA，不需要用phenol之类的有机溶剂，感觉可
能不仅提取速度快一些，而且少一些有毒有机溶剂，还不需要担心DNAse处理可能带来
的降解和其他问题，也同时减少了DNAse处理所需时间。
据说quality差不多，但是不知道产量如何。一般说column based的产量都要小一点。
但是如果能够达到比如80-90% TRIzol based protocol的产量，我觉得就很好了，毕竟
DNAse处理的时候还要丢失一些。
有人用过Promega这个Kit的人能分享一下经验吗？
谢谢！ |
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c********b
发帖数: 363 | 37 万能的trizol不是简单又好用吗？
放狗查trizol同时提RNA,蛋白，DNA |
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i****t
发帖数: 58 | 38 今天提取RNA,方法是先trizol碾磨保存样品（取样品要用很长时间，不能马上提取），
然后解冻加chloroform（200ul/1ml Trizol）离心取上清液,再直接用RNeasy kit提取
（就是先ethanol再...）。得到的RNA，260/280很好，但260/230较低。大家能否给点
建议，能怎样纯化一下，得到的RNA量较低（35ng/ul for 25 ul）？RNA是用来做qPCR
的，担心是不是phenol而影响酶活性。谢谢 |
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v****e
发帖数: 131 | 39 最近用老鼠组织提RNA，准备做microarray，可是RNA降解了。损失了`20个老鼠，非常
不幸。
dissect tissue，每个老鼠take 10分钟，因为比较难剥。是不是这个原因？放在RNA
LATER里比较难剥，因为变硬了。
然后就直接把tiisue放在液氮里了。抽的时候，放在trizol里。用匀浆器打散，抽提。
最后用RNAEASY纯化，
大家觉得有什么问题？有人和我说用液氮磨碎组织再加trizol，有用吗？谢谢 |
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b*******n
发帖数: 8420 | 40 prostate这个组织确实很tricky
因为这玩意本身有很多腺体，在解剖的时候会释放出大量的各种RNase protease之类的
东西，所以只用TRIZOL的话RNA会降解
所以要么就用RNA later，可以保证不降解
要么就是液氮低温处理再加TRIZOL
你最好问问专门做prostate的人要他们的protocol看看，可以少走些弯路 |
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v***2
发帖数: 131 | 42 急问：石蜡包埋的切片（样本是细胞）怎样提取DNA？
能否用Trizol提取？是否提取前应该先用xylene和酒精逐步脱蜡（如同antigen
retrivel），然后再用trizol提取？需要prokenase K处理吗？如果不用kits， 有没有
好的protocol？有什么要注意的，目的是作qPCR
先谢谢各位朋友了 |
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y*****u
发帖数: 31 | 43 用TRIZOL同时提临床得来的病人组织的RNA和DNA.之前一直觉得RNA很稳定没问题，在好
不容易凑足了DNA后送出测序，结果回馈说RNA降解了，而DNA浓度和我们测出的浓度相
差100倍。惊呆了。
1. DNA浓度我是用NANODROP测了好几次，不明白为啥测序公司测出来的数值会和我测出
来的差100倍？？？
2.RNA我后来把剩下的跑了胶，发现的确降解。现在又得到新的组织再提，还是发现有
降解情况。我以前都是做现杀的老鼠组织提RNA,手法我也一直没问题。这个新的临床标
本据说是病人手术切下之后一直低温保存，有实验需要就用干冰运来。第一次是保存在
TRIZOL里运来，第二次是直接运组织，我用液态氮碾碎了。但是都提出了降解的RNA.
我现在打算用细胞用同样的手法提RNA作为对比，看是否我的实验有问题？还是标本已
经降解的了。请问细胞提出的RNA对于组织RNA是否有参考性？
如果标本有问题，我现在提出的已经降解的RNA是否也能进行测序呢？效果如何？ |
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s********8
发帖数: 619 | 44 有人有经验吗?
手上的课题需要从极少量的FACSed细胞中提取RNA做RNAseq.现在一次sorting只能拿到
差不多3000个细胞,运气好的话应该一次可以拿到6000个细胞.
本来打算直接sort到Trizol里面冻起来,这样多sort几次,攒在一起提RNA.可是FACS
facility又不让我用Trizol,所以现在是sort到 RNaqueous micro kit 的lysis buffer
里.提完了RNA一测,几乎啥也测不出来,因为大概也只有十几个ng的样子.
所以我是不是应该考虑用commercial kit来做个amplification?求大牛推荐kit或者好
的方法! |
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a******n
发帖数: 45 | 45 如果RNA量大的话， trizol 》DNase I treatment 》Qiagen RNeasy Mini Kit
purify。 量小的话，RNeasy plus micro kit或者Life Arcturus Picopure RNA
isolation Kit， on column DNase digestion。不要直接用trizol提的RNA做library
，纯度不够。 |
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e********c
发帖数: 30 | 46 再问个问题。因为流式faclility不让用Trizol收集sorting后的细胞，他们说可以收集
到100ul的PBS/2%FBS里。
请问这样的话，收集在PBS/2%FBS里的细胞是直接放在冰上，还是赶紧在干冰上冻起来
？一般细胞在加Trizol之前大概要放个2个小时。
多谢！ |
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x********e
发帖数: 35261 | 47 借口。Trizol之类的传统方式也可以提，只不过是把试剂分装一下放盒子里罢了。 做
提RNA试剂盒的公司不要太多，colomn可以分开买甚至不用。 |
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w****e
发帖数: 14 | 48 It depends on how you want to use those RNAs.
I think if you try to do any reaction with them, it is not good to have a
trace
of ethanol. but if you want to extract mRNAs or do electrophoresis, it may not
matter.
BTW, have you tried to heat it at 65 degree for 10 minutes? it should help
dissolving RNAs.
The trizol protocol recommends to air dry RNAs for about 10 minutes, which
usually can results a little ethanol in the tube. |
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M****e
发帖数: 70 | 49 i have never worked with plant, so i do not know whether this
could be due to sth that cuase higher obsorbance at 260nm.
the ratio for isolated RNA from animal tissues is usually 1.7-
2.0 for my experience, and it pretty much depends upon what
kind of kit/reagent i use. i try TRIZol (Invitrogen), which
is pretty good, but sometimes RNA from pancreas will degrade
with no mercy. i also use RNeasy Kit (Qiagen), which is said
to be better, particularly working for microarray purpose.
i would recomme |
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f******s
发帖数: 115 | 50 我提取完组织后立刻放到rna later (qiagen)中 4摄氏度过夜后转到-20度 2周后开始
提取rna 但是发现里面有冰块？还是结晶块？这些东西要还是不要？我后面用trizol法
提 |
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