K********g
发帖数: 58 | 1 addgene说用直接anneal两个长引物，然后用phusion生成双链
请问高手们给个protocol吧。 |
C****n
发帖数: 79 | 2 由于要在不同的物种里试，Addgene的载体对我来说，就是Cas9的序列和gRNA的
tracrRNA部分可以用。我是直接用PCR的，设计了一个很长的引物，直接把20bp的gRNA
加在upstream primer上。 |
b******9
发帖数: 102 | 3 看你是用什么载体，有直接将oligo退火然后GoldenGate克隆的（比如张峰lab的）；也
有把整个U6 expression cassette 通过overlap PCR 或者 Gibson 拼起来插到载体里
的（比如Church lab） |
K********g
发帖数: 58 | 4 I want use the church's gRNA cloning vector
http://www.addgene.org/4184
thanks |
K********g
发帖数: 58 | 5 so ask for the anneal and phusion extension protocol, thanks
gRNA
【在 C****n 的大作中提到】
: 由于要在不同的物种里试，Addgene的载体对我来说，就是Cas9的序列和gRNA的
: tracrRNA部分可以用。我是直接用PCR的，设计了一个很长的引物，直接把20bp的gRNA
: 加在upstream primer上。
|
l***y
发帖数: 638 | 6 church的这个质粒克隆很麻烦，还不如直接gBlock合成
其实你可以去搞一个zhang feng的质粒把gRNA casette弄出来随便找个质粒一插，然后
用他的protocol克隆
【在 K********g 的大作中提到】
: I want use the church's gRNA cloning vector
: http://www.addgene.org/4184
: thanks
|
b******9
发帖数: 102 | 7 1. Gibson assemble,这个就是设计引物的时候两个PCR片段之间（U6 expression
cassette可以分成一个固定的，一个包含 target sequence的可变的），PCR片段和载
体之间要有overlap。
2.ovrelap PCR：两个PCR片段之间有overlap，先单独扩，分别扩增完之后再用Taq酶拼
起来，记得加3%DMSO。回收完了直接连T载体。
【在 K********g 的大作中提到】
: I want use the church's gRNA cloning vector
: http://www.addgene.org/4184
: thanks
|
m*****z
发帖数: 1451 | 8 addgene上有protocol啊。
【在 K********g 的大作中提到】
: so ask for the anneal and phusion extension protocol, thanks
:
: gRNA
|
