c*********u
发帖数: 3128 | 1 要求能跑出4kb左右，突变尽量少，最好没有。
对于GC含量高的，大家用什么？
最近在钓基因，用TAKARA的LA和NEB的phusion，但最终得到的序列突变太多，没法用。
老板脸色越来越不好看了 |
s******y
发帖数: 28562 | 2 4kb is not too long ah.
I used to Pfu Turbo (Strategen) for a gene at that length with GC% =65% and
it works fine. I added 0.1% DMSO in the buffer.
Another suggestion is, you can try to amplify two fragments in the same gene
seperately and then ligate them together later. I found it easier for
tricky sequences.
【在 c*********u 的大作中提到】
: 要求能跑出4kb左右，突变尽量少，最好没有。
: 对于GC含量高的，大家用什么？
: 最近在钓基因，用TAKARA的LA和NEB的phusion，但最终得到的序列突变太多，没法用。
: 老板脸色越来越不好看了
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b******n
发帖数: 4225 | 3 好像stratagen的PfuUltra(TM) high-fidelity DNA polymerase还不错
我们做点突变一直用它
实在不行你可以分成两段做PCR
【在 c*********u 的大作中提到】
: 要求能跑出4kb左右，突变尽量少，最好没有。
: 对于GC含量高的，大家用什么？
: 最近在钓基因，用TAKARA的LA和NEB的phusion，但最终得到的序列突变太多，没法用。
: 老板脸色越来越不好看了
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g*****y
发帖数: 6325 | 4 加DMSO会提高突变率。
and
gene
【在 s******y 的大作中提到】
: 4kb is not too long ah.
: I used to Pfu Turbo (Strategen) for a gene at that length with GC% =65% and
: it works fine. I added 0.1% DMSO in the buffer.
: Another suggestion is, you can try to amplify two fragments in the same gene
: seperately and then ligate them together later. I found it easier for
: tricky sequences.
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s******y
发帖数: 28562 | 5 没错，是会提高突变率，但那是没有办法的办法（不然高GC的序列扩不出来）
所以必须用pfu turbo
【在 g*****y 的大作中提到】
: 加DMSO会提高突变率。
:
: and
: gene
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y****i
发帖数: 2194 | 6 Herculase from Stratagene,
great for long and high GC PCR
【在 c*********u 的大作中提到】
: 要求能跑出4kb左右，突变尽量少，最好没有。
: 对于GC含量高的，大家用什么？
: 最近在钓基因，用TAKARA的LA和NEB的phusion，但最终得到的序列突变太多，没法用。
: 老板脸色越来越不好看了
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c*********u
发帖数: 3128 | 7 Could you please let me know the catalog # ?
The stratagen company seems disappeared.
【在 b******n 的大作中提到】
: 好像stratagen的PfuUltra(TM) high-fidelity DNA polymerase还不错
: 我们做点突变一直用它
: 实在不行你可以分成两段做PCR
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g*****y
发帖数: 6325 | 8 wow, doing DNA work but don't know stratagene??
【在 c*********u 的大作中提到】
: Could you please let me know the catalog # ?
: The stratagen company seems disappeared.
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c*********u
发帖数: 3128 | 9 Sorry, I never used it
【在 g*****y 的大作中提到】
: wow, doing DNA work but don't know stratagene??
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b******n
发帖数: 4225 | 10 600385
现在跟Agilent合并了
【在 c*********u 的大作中提到】
: Could you please let me know the catalog # ?
: The stratagen company seems disappeared.
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c*********u
发帖数: 3128 | 11 Thanks, did you try the 2nd generation product of this kit?
【在 b******n 的大作中提到】
: 600385
: 现在跟Agilent合并了
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b******n
发帖数: 4225 | 12 没，这个已经不错了
2nd是不是就是那种master mix之类的，
反正我们一般都现做先用。
【在 c*********u 的大作中提到】
: Thanks, did you try the 2nd generation product of this kit?
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c*********u
发帖数: 3128 | 13 thanks, you are a nice guy
【在 b******n 的大作中提到】
: 没，这个已经不错了
: 2nd是不是就是那种master mix之类的，
: 反正我们一般都现做先用。
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