real-time PCR遇到好多问题，求高人指点 - Biology版

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Biology版 - real-time PCR遇到好多问题，求高人指点

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话题: pcr话题: melting话题: cdna话题: real话题: 单峰

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y*******a
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我是在一种genomic information未知的植物里做real-time PCR。此植物为四倍体，且
自交不亲和。一般是先根据同源性设计引物扩部分DNA片段，然后测序再设计real-
time PCR的引物。拿到引物我会先将Wildtype plant的cDNA用普通PCR仪扩增试一下退
火温度并且跑胶检验40个循环后是否条带单一。确定是单一条带了，会进行大量real-
time实验（Biorad-sybr）。这时悲剧就发生了。有如下一些问题：
1. 同一种cDNA sample的3个技术重复，melting curve不同，有时全是单峰，但不重合
，相差很远；有时3个重复里有单峰也有多峰。
2. 不同cDNA sample之间（WT vs. TG 或者stress treatment at different time
points）melting curve不同，在某个sample里很好全是单峰，在另一sample里就乱了。
3. real-time后跑胶，的确很多带。可是之前用普通PCR扩增，相同program，跑胶是一
条带。
自己的分析是：因为是四倍体，又是自交不亲和，导致同源序列很多，扩增特异性差，
所以melting curve 不是单峰，跑胶多条带。另外，cDNA samples在不同stress处理下
会有alternative splicing，导致不同样品之间melting curve不一致。另外还要请教
大家一个问题，single nucleotide difference可以通过real-time的melting curve区
分开吗？
已被困扰多时，真诚请教大家～

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