r******k
发帖数: 446 | 1 我构建的质粒HA-NLS （nuclear localization sequence）- gene- flag。
好像表达了一个HA-NLS-gene-flag。 又表达了一个 gene-flag。 怎么办？ 把我要的
基因的atg pcr掉？重新做质粒？thank you！！！！ |
T****u
发帖数: 424 | 2 mutagenesis掉
【在 r******k 的大作中提到】
: 我构建的质粒HA-NLS （nuclear localization sequence）- gene- flag。
: 好像表达了一个HA-NLS-gene-flag。 又表达了一个 gene-flag。 怎么办？ 把我要的
: 基因的atg pcr掉？重新做质粒？thank you！！！！
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q***7
发帖数: 144 | 3 检查一下你 HA-NLS-gene-Flag中的gene是否还保留有ATG。做融合蛋白表达时一个新手
常犯的错误就是保留基因自身的ATG，有时候翻译会从这里开始。造成两个或多个蛋白
表达。
另外一个应该特别注意的就是Stop Codon，在原核中表达就要用原核的常用的Stop
Codon，真核表达就用真核的，而且至少加两个，两个常用的，或一个常用，一个次常
用的。
做突变很可能在其他地方引入其他突变，如果用kit价格上很贵，不如重新做。
做克隆提高克隆效率及降低费用请用这个kit.
http://www.greenbioresearch.com/gel-extraction-pcr-purification
http://www.greenbioresearch.com/plasmid-dna-miniprep-isolation- |
j****x
发帖数: 1704 | 4 保留gene自身的ATG也能叫错误？
BTW，无论真核原核，mRNA天然的stop codon，有多大比例是有两个的？谢谢
【在 q***7 的大作中提到】
: 检查一下你 HA-NLS-gene-Flag中的gene是否还保留有ATG。做融合蛋白表达时一个新手
: 常犯的错误就是保留基因自身的ATG，有时候翻译会从这里开始。造成两个或多个蛋白
: 表达。
: 另外一个应该特别注意的就是Stop Codon，在原核中表达就要用原核的常用的Stop
: Codon，真核表达就用真核的，而且至少加两个，两个常用的，或一个常用，一个次常
: 用的。
: 做突变很可能在其他地方引入其他突变，如果用kit价格上很贵，不如重新做。
: 做克隆提高克隆效率及降低费用请用这个kit.
: http://www.greenbioresearch.com/gel-extraction-pcr-purification
: http://www.greenbioresearch.com/plasmid-dna-miniprep-isolation-
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q***7
发帖数: 144 | 5 如果你是做蛋白表达纯化出身的，你就知道做融合蛋白时，一般都会把后面那个基因
ATG去掉。你可以不叫他错误，但是有时候你回得到多个表达蛋白。
关于Stop codon，你可以在GOOGLE里搜索一下，真核生物（例如人）和原核生物（如E.
coli)的密码子使用频率表，你会发现他们对终止密码子，不是只用一个，而是机率不
同。只放一个终止密码子有时会造成通读，你蛋白表达纯化是有时看到比你预测的大的
蛋白有时就是通读造成的。
有什么问题欢迎提问，谢谢
【在 j****x 的大作中提到】
: 保留gene自身的ATG也能叫错误？
: BTW，无论真核原核，mRNA天然的stop codon，有多大比例是有两个的？谢谢
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j****x
发帖数: 1704 | 6 你知道一个蛋白编码序列中中，有多少个ATG吗？又有多少个可以作为start codon的
ATG吗？
第二个问题，我觉得所答非所问，或者我没理解你的意思。我重复一遍我的问题，天然
mRNA有多少使用连续两个stop codon的，又有多少出现过通读。谢谢。
E.
【在 q***7 的大作中提到】
: 如果你是做蛋白表达纯化出身的，你就知道做融合蛋白时，一般都会把后面那个基因
: ATG去掉。你可以不叫他错误，但是有时候你回得到多个表达蛋白。
: 关于Stop codon，你可以在GOOGLE里搜索一下，真核生物（例如人）和原核生物（如E.
: coli)的密码子使用频率表，你会发现他们对终止密码子，不是只用一个，而是机率不
: 同。只放一个终止密码子有时会造成通读，你蛋白表达纯化是有时看到比你预测的大的
: 蛋白有时就是通读造成的。
: 有什么问题欢迎提问，谢谢
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s********x
发帖数: 472 | 7 大部分时候确实没必要去掉atg，但是偶尔会有内部initiation的时候。
很对时候可能是设计的atg附近序列缺乏足够强的ribosome识别，或者碰巧蛋白中段有
类似ires的序列。
如果出现突变掉atg就好了。
至于stop codon，一个确实有一定的读传概率，如果是舜转大量的dna，往往回detect
读穿。但是如果是knock in 一两个copy，一般检测不到读穿，当然总会有微量的。每
次都加多个stop有点强迫，不过确实可能有帮助，只不过大多数没用。 |
q***7
发帖数: 144 | 8 你拿个具体的序列来自己数一下不就知道啦？至于一个基因内部的ATG有没有可能
ribosome作为其实进入起始另外一个蛋白翻译，你可以放狗狗里搜一下，这个我没有时
间来回答
另外，一个基因在其自然情况大都是一个，这个搞大规模预测的都有这方面文章发表，
有时间了自己好好做做工课。我们这里讨论的拿到质粒上来表达，离开了其自然选择的
前后基因序列你是不确定它会选择那个来做终止密码子，为了保险做好加入要表达宿主
最偏爱的另外再加一个第二偏爱的。我们搞表达的经常会发现重做新加另外一个终止密
码子后通读就消失了。
【在 j****x 的大作中提到】
: 你知道一个蛋白编码序列中中，有多少个ATG吗？又有多少个可以作为start codon的
: ATG吗？
: 第二个问题，我觉得所答非所问，或者我没理解你的意思。我重复一遍我的问题，天然
: mRNA有多少使用连续两个stop codon的，又有多少出现过通读。谢谢。
:
: E.
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j****x
发帖数: 1704 | 9 很明显，关于这两个问题前面一个回帖要有营养的多，而不是用一个什么“初学者的常
见错误”来摆谱。
其实我很清楚这两个问题的答案是什么，远不是某些人理解的那么单一。我当初开始做
表达纯化的时候，导师就告诉我要知其然还要知其所以然。不过我也知道身边不少只做
某一专门方向或领域的人容易教条或者说，容易固执，把某些tips当成是金科玉律雷打
不动，不过这也可以理解。
【在 q***7 的大作中提到】
: 你拿个具体的序列来自己数一下不就知道啦？至于一个基因内部的ATG有没有可能
: ribosome作为其实进入起始另外一个蛋白翻译，你可以放狗狗里搜一下，这个我没有时
: 间来回答
: 另外，一个基因在其自然情况大都是一个，这个搞大规模预测的都有这方面文章发表，
: 有时间了自己好好做做工课。我们这里讨论的拿到质粒上来表达，离开了其自然选择的
: 前后基因序列你是不确定它会选择那个来做终止密码子，为了保险做好加入要表达宿主
: 最偏爱的另外再加一个第二偏爱的。我们搞表达的经常会发现重做新加另外一个终止密
: 码子后通读就消失了。
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l******a
发帖数: 3339 | 10 说实话，你太不虚心了，我就是一个路过打酱油的。但是我觉得3楼说的很对。在楼主
的这个case中，他做的是fusion protein，前面放了signal peptide，应该去掉
methione，防止alternative translation，后面加两个stop codon也是常做的。我不
觉得这是tip，这就是常识。3楼拿出来给大家分享是好的，反倒觉得你想是在说教。
【在 j****x 的大作中提到】
: 很明显，关于这两个问题前面一个回帖要有营养的多，而不是用一个什么“初学者的常
: 见错误”来摆谱。
: 其实我很清楚这两个问题的答案是什么，远不是某些人理解的那么单一。我当初开始做
: 表达纯化的时候，导师就告诉我要知其然还要知其所以然。不过我也知道身边不少只做
: 某一专门方向或领域的人容易教条或者说，容易固执，把某些tips当成是金科玉律雷打
: 不动，不过这也可以理解。
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r******k
发帖数: 446 | 11 Yes i have an ires system!
【在 q***7 的大作中提到】
: 你拿个具体的序列来自己数一下不就知道啦？至于一个基因内部的ATG有没有可能
: ribosome作为其实进入起始另外一个蛋白翻译，你可以放狗狗里搜一下，这个我没有时
: 间来回答
: 另外，一个基因在其自然情况大都是一个，这个搞大规模预测的都有这方面文章发表，
: 有时间了自己好好做做工课。我们这里讨论的拿到质粒上来表达，离开了其自然选择的
: 前后基因序列你是不确定它会选择那个来做终止密码子，为了保险做好加入要表达宿主
: 最偏爱的另外再加一个第二偏爱的。我们搞表达的经常会发现重做新加另外一个终止密
: 码子后通读就消失了。
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j****x
发帖数: 1704 | 12 说实话，这里能有什么可说教的？三楼认为不去除融合蛋白后面那个ORF里的ATG算是一
个初级错误，我不认同而已。融合蛋白表达载体，无论商用还是文献中报道的，保留后
面ORF里ATG的一大把。它们的设计者是不是都是犯了初级错误的初学者呢？实践中如果
确认出现了alternative translation,需要“检讨”的，首先应该是载体/序列设计：
前面fusion peptide的起始ATG是否存在最佳的Kozak consensus；转录起始位点到翻译
起始位点之间是否有足够的空间是否有特殊的序列/结构；序列中是否有IRES，位置是
不是有问题。而不是单纯把原因归结到没有去处后面ORF里的ATG。做改造的时候也未必
就非得突变下游ATG，因为如果前面的根源不解决，就算去除了后面ORF的起始ATG，整
个序列中也大概率会有其他ATG可能作为alternative translation的起始，所谓治标不
治本。至于终止翻译时连续使用两个甚至三个stop codon，我在需要的时候也这么做过
，但不会简单的把这种做法当成“金科玉律”，会分情况选择使用，当做tip推荐给别
人的时候也会解释原因，而不是以一句“这就是常识”敷衍，至少考虑一下听者的感受
。这是我和三楼争辩的本意，如果让人觉得我不虚心，那我反思一下。
【在 l******a 的大作中提到】
: 说实话，你太不虚心了，我就是一个路过打酱油的。但是我觉得3楼说的很对。在楼主
: 的这个case中，他做的是fusion protein，前面放了signal peptide，应该去掉
: methione，防止alternative translation，后面加两个stop codon也是常做的。我不
: 觉得这是tip，这就是常识。3楼拿出来给大家分享是好的，反倒觉得你想是在说教。
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m******5
发帖数: 1383 | 13 同意！！
另外有一点，我觉得很多人都觉得上下两条带是alternative translation，其实很可
能是其它Sumo或者Ubiquitin或者磷酸化修饰导致的。alternative translation的可能
性我认为不大。
另一种更常见的情况是下面那条带其实是N-termianl truncation band.
我认为这几种情况都比alternative translation可能性大得多。
在楼主的case里，甚至有可能上下两条带都是Full-Length，只不过Flag antibody
affinity比HA antibody高很多，导致楼主误以为下面没有HA tag.
很多蛋白都有multiple in frame的ATG,通常后面的ATG是不会起作用的(除非有
alternative splicing或者复杂的RNA secondary structure.)
退一万步说，除了in frame的ATG,还有很多非in frame的ATG，设想一下，如果这些ATG
能起作用，细胞早就被junk protein淹没了(当然，非in frame产物如果不在最后的
exon终止会被NMD去掉)
【在 j****x 的大作中提到】
: 说实话，这里能有什么可说教的？三楼认为不去除融合蛋白后面那个ORF里的ATG算是一
: 个初级错误，我不认同而已。融合蛋白表达载体，无论商用还是文献中报道的，保留后
: 面ORF里ATG的一大把。它们的设计者是不是都是犯了初级错误的初学者呢？实践中如果
: 确认出现了alternative translation,需要“检讨”的，首先应该是载体/序列设计：
: 前面fusion peptide的起始ATG是否存在最佳的Kozak consensus；转录起始位点到翻译
: 起始位点之间是否有足够的空间是否有特殊的序列/结构；序列中是否有IRES，位置是
: 不是有问题。而不是单纯把原因归结到没有去处后面ORF里的ATG。做改造的时候也未必
: 就非得突变下游ATG，因为如果前面的根源不解决，就算去除了后面ORF的起始ATG，整
: 个序列中也大概率会有其他ATG可能作为alternative translation的起始，所谓治标不
: 治本。至于终止翻译时连续使用两个甚至三个stop codon，我在需要的时候也这么做过
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l******a
发帖数: 3339 | 14 Most fusion case, it does not matter. You want to keep the methionine, keep
it, it wont do a damn thing. But here is a short signal peptide fusion, so I
say remove the methionine. clear?
I dont know what "初级错误" he was talking about. I am just saying, what he
said make sense to me, and I would do the exact same thing for this case,
period.
【在 j****x 的大作中提到】
: 说实话，这里能有什么可说教的？三楼认为不去除融合蛋白后面那个ORF里的ATG算是一
: 个初级错误，我不认同而已。融合蛋白表达载体，无论商用还是文献中报道的，保留后
: 面ORF里ATG的一大把。它们的设计者是不是都是犯了初级错误的初学者呢？实践中如果
: 确认出现了alternative translation,需要“检讨”的，首先应该是载体/序列设计：
: 前面fusion peptide的起始ATG是否存在最佳的Kozak consensus；转录起始位点到翻译
: 起始位点之间是否有足够的空间是否有特殊的序列/结构；序列中是否有IRES，位置是
: 不是有问题。而不是单纯把原因归结到没有去处后面ORF里的ATG。做改造的时候也未必
: 就非得突变下游ATG，因为如果前面的根源不解决，就算去除了后面ORF的起始ATG，整
: 个序列中也大概率会有其他ATG可能作为alternative translation的起始，所谓治标不
: 治本。至于终止翻译时连续使用两个甚至三个stop codon，我在需要的时候也这么做过
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l******a
发帖数: 3339 | 15 see my reply above.
【在 m******5 的大作中提到】
: 同意！！
: 另外有一点，我觉得很多人都觉得上下两条带是alternative translation，其实很可
: 能是其它Sumo或者Ubiquitin或者磷酸化修饰导致的。alternative translation的可能
: 性我认为不大。
: 另一种更常见的情况是下面那条带其实是N-termianl truncation band.
: 我认为这几种情况都比alternative translation可能性大得多。
: 在楼主的case里，甚至有可能上下两条带都是Full-Length，只不过Flag antibody
: affinity比HA antibody高很多，导致楼主误以为下面没有HA tag.
: 很多蛋白都有multiple in frame的ATG,通常后面的ATG是不会起作用的(除非有
: alternative splicing或者复杂的RNA secondary structure.)
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s*********y
发帖数: 292 | 16 问下，一个蛋白如果有好多个Met，每个ATG都有可能开始翻译吗？ |
c**********r
发帖数: 138 | 17 情商太低.
说实话，这里能有什么可说教的？三楼认为不去除融合蛋白后面那个ORF里的ATG算是一
个初级错误，我不认同而已。融合蛋白表达载体，无论商用还是文献中报道的，保留后
面ORF里ATG的........
【在 j****x 的大作中提到】
: 说实话，这里能有什么可说教的？三楼认为不去除融合蛋白后面那个ORF里的ATG算是一
: 个初级错误，我不认同而已。融合蛋白表达载体，无论商用还是文献中报道的，保留后
: 面ORF里ATG的一大把。它们的设计者是不是都是犯了初级错误的初学者呢？实践中如果
: 确认出现了alternative translation,需要“检讨”的，首先应该是载体/序列设计：
: 前面fusion peptide的起始ATG是否存在最佳的Kozak consensus；转录起始位点到翻译
: 起始位点之间是否有足够的空间是否有特殊的序列/结构；序列中是否有IRES，位置是
: 不是有问题。而不是单纯把原因归结到没有去处后面ORF里的ATG。做改造的时候也未必
: 就非得突变下游ATG，因为如果前面的根源不解决，就算去除了后面ORF的起始ATG，整
: 个序列中也大概率会有其他ATG可能作为alternative translation的起始，所谓治标不
: 治本。至于终止翻译时连续使用两个甚至三个stop codon，我在需要的时候也这么做过
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j****x
发帖数: 1704 | 18 我觉得我前面的帖子已经解释的很清楚了...好吧，即便是这个case里的N-terminal HA
Tag（-NLS）的表达载体，能查到的商用的或是自建的有很多都不去除后面那个Met，
我手头几种载体的manual中也没有特殊说明需要专门去除，只是强调in frame
insertion。
所以，套用你的话，这个Met你愿意删掉就删掉，nobody cares。而这种tip到底算不算
你所谓的“常识”，反正也没个标准，大可不必争了。如果你手边有哪个商用载体明确
指出推荐去除后面的Met，请分享，谢谢。我想说的是，三楼把没有去除Met这一点当成
是LZ出现问题的解释和解决方法，我觉得值得商榷，真正问题根源所在很可能并不在此
，原因我和LZ一位朋友已经解释了，如果你不同意，可以继续讨论。如果你不知道三楼
所说的“初级错误”是指什么，那么关于这一点我们这里也没什么好纠缠的了。
keep
I
he
【在 l******a 的大作中提到】
: Most fusion case, it does not matter. You want to keep the methionine, keep
: it, it wont do a damn thing. But here is a short signal peptide fusion, so I
: say remove the methionine. clear?
: I dont know what "初级错误" he was talking about. I am just saying, what he
: said make sense to me, and I would do the exact same thing for this case,
: period.
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j****x
发帖数: 1704 | 19 以下来自教科书的经典理论（个人理解，欢迎纠错）：
原核mRNA，SD序列之后的第一个ATG，就是起始ATG，其他的都歇菜（多顺反子每个单算
）。
真核mRNA，mG7 cap后第一个“适宜”的ATG为起始ATG。至于怎么定义“适宜”，目前
还没完全彻底的搞清楚，但ATG所处的sequence context是关键因素这一点是很明确的
，统计上讲就是所谓的kozak consensus（(gcc)gccAccAUGG）。既然是统计规律，自然
就有大量的反例，所以过往在做genome/mRNA annotation的时候有很多预测出来的CDS
是错误的，或者不完整，5'端有遗漏，这个问题至今在bioinformatics界也没有被彻底
解决，对于novel/unknown mRNA，究竟哪个ATG才是起始ATG，还是需要实验来验证。
真核mRNA能同时编码2个甚至2个以上蛋白产物的情况也有，在病毒编码mRNA中尤其多见
。往往是第一起始ATG所处的context不那么理想，或者序列中包含IRES或存在其他内部
起始机制。另一方面，细胞内会随机出现从非标准起始ATG开始翻译的事件，但大多数
情况下会通过NMD机制来消除其负面效应。
此外，mRNA中标准起始ATG上游其他ATG（uATG）的存在是在翻译水平调控该蛋白表达的
机制之一，5'UTR中的uATG往往会负调控该蛋白的表达，通过干扰核糖体对标准起始ATG
的识别来实现。
【在 s*********y 的大作中提到】
: 问下，一个蛋白如果有好多个Met，每个ATG都有可能开始翻译吗？
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a*******a
发帖数: 4233 | 20 second this
detect
【在 s********x 的大作中提到】
: 大部分时候确实没必要去掉atg，但是偶尔会有内部initiation的时候。
: 很对时候可能是设计的atg附近序列缺乏足够强的ribosome识别，或者碰巧蛋白中段有
: 类似ires的序列。
: 如果出现突变掉atg就好了。
: 至于stop codon，一个确实有一定的读传概率，如果是舜转大量的dna，往往回detect
: 读穿。但是如果是knock in 一两个copy，一般检测不到读穿，当然总会有微量的。每
: 次都加多个stop有点强迫，不过确实可能有帮助，只不过大多数没用。
|
r******k
发帖数: 446 | 21 您好 sto condon应该加在那里呢？
加在NLS的后面 我要的gene的前面吗？
【在 q***7 的大作中提到】
: 检查一下你 HA-NLS-gene-Flag中的gene是否还保留有ATG。做融合蛋白表达时一个新手
: 常犯的错误就是保留基因自身的ATG，有时候翻译会从这里开始。造成两个或多个蛋白
: 表达。
: 另外一个应该特别注意的就是Stop Codon，在原核中表达就要用原核的常用的Stop
: Codon，真核表达就用真核的，而且至少加两个，两个常用的，或一个常用，一个次常
: 用的。
: 做突变很可能在其他地方引入其他突变，如果用kit价格上很贵，不如重新做。
: 做克隆提高克隆效率及降低费用请用这个kit.
: http://www.greenbioresearch.com/gel-extraction-pcr-purification
: http://www.greenbioresearch.com/plasmid-dna-miniprep-isolation-
|
