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Biology版 - EMSA 没有结果
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请教做EMSA的高手,protein狂bind probe?!请教高手如何胶回收17Kb质粒
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求助有关EMSA 的问题short double strand DNA dissociates automatically??
从纯化到星辰---CSH蛋白质纯化课侧记(十五)请大家不要再用有毒的EB溴化乙淀试剂了!
做SDSPAGE胶总是凝太快做不漂亮请支招!EMSA 的问题
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f*****e
发帖数: 223
1
用的是Pierce LightShift® Chemiluminescent EMSA Kit, 电泳用Biorad TBE
precast Gel。 按照说明书改变过glycerol和 NP40的量,但总没有shift 和
supershift的条带。探针区域ChIP结果阳性。 请教有啥高招啊
s******y
发帖数: 28562
2
Do you have positive control?
If this is your first time doing this, then you need both positive and
negative controls

【在 f*****e 的大作中提到】
: 用的是Pierce LightShift® Chemiluminescent EMSA Kit, 电泳用Biorad TBE
: precast Gel。 按照说明书改变过glycerol和 NP40的量,但总没有shift 和
: supershift的条带。探针区域ChIP结果阳性。 请教有啥高招啊

d****7
发帖数: 109
3
如sunnyday所说,加点control试试
EMSA里的学问还是挺大的,你得做做optimisation,否则结果不会好看的。
首先,你用的是nuclear extract还是纯化的蛋白?纯化的蛋白要比nuclear extract好
很多,不过如果你的蛋白不是transcription factor的话,也只能用nuclear extract
了,细节可以看看研究转录的圣经《Transcriptional Regulation in Eukaryotes:
Concepts, Strategies, and Techniqes: Concepts, Strategies and Techniques》
盐浓度也很重要,很多蛋白-DNA都是salt dependent,而且不同蛋白需要的optimal盐
浓度不一样,比如SRF我们用150 mM盐,但是150mM盐做Forkhead的话,基本上都是非常
弱的binding,调到75 mM正好适合Forkhead。所以需要做个salt titration.
另外non-specific DNA的选择也非常重要,不同的non-specific DNA会给出不同的结果
,poly dI/dC和salmon sperm DNA两个选一个,或者混合起来,浓度需要自己调一下。
另外,胶里面含甘油吗?给胶里混点甘油会稳定 TF-DNA结合。
还有,TBE的浓度?有些TF-DNA在1X TBE或者0.5X TBE里面无法survive,所以需要降低
电泳液的离子强度,用0.25X TBE试试,还可以在cold room里面跑胶
没用过chemiluminescent EMSA,从来都是自己配东西,用32P dCTP做,效果很不错。
最后,ChIP有信号,不一定EMSA能做出来啊,所以不要陷入误区
如果这个EMSA对文章很重要,那就下点功夫琢磨琢磨,如果不重要,干脆别做了,麻烦
死了。。。

【在 f*****e 的大作中提到】
: 用的是Pierce LightShift® Chemiluminescent EMSA Kit, 电泳用Biorad TBE
: precast Gel。 按照说明书改变过glycerol和 NP40的量,但总没有shift 和
: supershift的条带。探针区域ChIP结果阳性。 请教有啥高招啊

L****e
发帖数: 499
4
dbrg77 兄弟真是个大好人啊。多谢了
f*****e
发帖数: 223
5
一, 有对照,每次都正确出现,
二, 这套系统用过,另外的两个拿到了结果,shift和supershift。
三, 核抽提物都是一个方法,浓度保持基本稳定,分成小管, -80保藏,每次一个,
没有用纯化蛋白
四, 试过不同盐浓度,没有做梯度,应该试一下,实在不行就放弃了
谢谢

extract

【在 d****7 的大作中提到】
: 如sunnyday所说,加点control试试
: EMSA里的学问还是挺大的,你得做做optimisation,否则结果不会好看的。
: 首先,你用的是nuclear extract还是纯化的蛋白?纯化的蛋白要比nuclear extract好
: 很多,不过如果你的蛋白不是transcription factor的话,也只能用nuclear extract
: 了,细节可以看看研究转录的圣经《Transcriptional Regulation in Eukaryotes:
: Concepts, Strategies, and Techniqes: Concepts, Strategies and Techniques》
: 盐浓度也很重要,很多蛋白-DNA都是salt dependent,而且不同蛋白需要的optimal盐
: 浓度不一样,比如SRF我们用150 mM盐,但是150mM盐做Forkhead的话,基本上都是非常
: 弱的binding,调到75 mM正好适合Forkhead。所以需要做个salt titration.
: 另外non-specific DNA的选择也非常重要,不同的non-specific DNA会给出不同的结果

a*****n
发帖数: 2835
6
上P32试试?

【在 f*****e 的大作中提到】
: 一, 有对照,每次都正确出现,
: 二, 这套系统用过,另外的两个拿到了结果,shift和supershift。
: 三, 核抽提物都是一个方法,浓度保持基本稳定,分成小管, -80保藏,每次一个,
: 没有用纯化蛋白
: 四, 试过不同盐浓度,没有做梯度,应该试一下,实在不行就放弃了
: 谢谢
:
: extract

f*****e
发帖数: 223
7
算了,现在对文章没追求,给别人打工混日子,不愿费那个劲,谢谢。不过,原来用
p32确实一次就出结果了

【在 a*****n 的大作中提到】
: 上P32试试?
y*****5
发帖数: 567
8
我没用过你的Kit,看起来很麻烦。我就是用SRBY green 染色替代了P32。普通DNA,
加上protein后跑个胶, 拿SRBY green 染30分钟,洗干净,用UVlight 看照相。这样
跑出来的带不如p32的sharp。但是如果有问题你可以看到你的DNA都去哪了。
a****o
发帖数: 1786
9
sometimes the concentration of Mg is very important
H*g
发帖数: 2333
10
我一直在用这个kit, 一直结果还好。 有shift, super-shift以及cold probe
competition。除了glycerol和NP-40, 你还需要调整Mg2+和K+的浓度。你的探针应该是
Biotin-labelled, 能具体说说“探针区域ChIP结果阳性”是什么意思吗?

【在 f*****e 的大作中提到】
: 用的是Pierce LightShift® Chemiluminescent EMSA Kit, 电泳用Biorad TBE
: precast Gel。 按照说明书改变过glycerol和 NP40的量,但总没有shift 和
: supershift的条带。探针区域ChIP结果阳性。 请教有啥高招啊

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