f*****e
发帖数: 223 | 1 用的是Pierce LightShift® Chemiluminescent EMSA Kit, 电泳用Biorad TBE
precast Gel。 按照说明书改变过glycerol和 NP40的量，但总没有shift 和
supershift的条带。探针区域ChIP结果阳性。 请教有啥高招啊 |
s******y
发帖数: 28562 | 2 Do you have positive control?
If this is your first time doing this, then you need both positive and
negative controls
【在 f*****e 的大作中提到】
: 用的是Pierce LightShift® Chemiluminescent EMSA Kit, 电泳用Biorad TBE
: precast Gel。 按照说明书改变过glycerol和 NP40的量，但总没有shift 和
: supershift的条带。探针区域ChIP结果阳性。 请教有啥高招啊
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d****7
发帖数: 109 | 3 如sunnyday所说，加点control试试
EMSA里的学问还是挺大的，你得做做optimisation，否则结果不会好看的。
首先，你用的是nuclear extract还是纯化的蛋白？纯化的蛋白要比nuclear extract好
很多，不过如果你的蛋白不是transcription factor的话，也只能用nuclear extract
了，细节可以看看研究转录的圣经《Transcriptional Regulation in Eukaryotes:
Concepts, Strategies, and Techniqes: Concepts, Strategies and Techniques》
盐浓度也很重要，很多蛋白－DNA都是salt dependent，而且不同蛋白需要的optimal盐
浓度不一样，比如SRF我们用150 mM盐，但是150mM盐做Forkhead的话，基本上都是非常
弱的binding，调到75 mM正好适合Forkhead。所以需要做个salt titration.
另外non-specific DNA的选择也非常重要，不同的non-specific DNA会给出不同的结果
，poly dI/dC和salmon sperm DNA两个选一个，或者混合起来，浓度需要自己调一下。
另外，胶里面含甘油吗？给胶里混点甘油会稳定 TF-DNA结合。
还有，TBE的浓度？有些TF-DNA在1X TBE或者0.5X TBE里面无法survive，所以需要降低
电泳液的离子强度，用0.25X TBE试试，还可以在cold room里面跑胶
没用过chemiluminescent EMSA，从来都是自己配东西，用32P dCTP做，效果很不错。
最后，ChIP有信号，不一定EMSA能做出来啊，所以不要陷入误区
如果这个EMSA对文章很重要，那就下点功夫琢磨琢磨，如果不重要，干脆别做了，麻烦
死了。。。
【在 f*****e 的大作中提到】
: 用的是Pierce LightShift® Chemiluminescent EMSA Kit, 电泳用Biorad TBE
: precast Gel。 按照说明书改变过glycerol和 NP40的量，但总没有shift 和
: supershift的条带。探针区域ChIP结果阳性。 请教有啥高招啊
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L****e
发帖数: 499 | |
f*****e
发帖数: 223 | 5 一， 有对照，每次都正确出现，
二， 这套系统用过，另外的两个拿到了结果，shift和supershift。
三， 核抽提物都是一个方法，浓度保持基本稳定，分成小管， -80保藏，每次一个，
没有用纯化蛋白
四， 试过不同盐浓度，没有做梯度，应该试一下，实在不行就放弃了
谢谢
extract
【在 d****7 的大作中提到】
: 如sunnyday所说，加点control试试
: EMSA里的学问还是挺大的，你得做做optimisation，否则结果不会好看的。
: 首先，你用的是nuclear extract还是纯化的蛋白？纯化的蛋白要比nuclear extract好
: 很多，不过如果你的蛋白不是transcription factor的话，也只能用nuclear extract
: 了，细节可以看看研究转录的圣经《Transcriptional Regulation in Eukaryotes:
: Concepts, Strategies, and Techniqes: Concepts, Strategies and Techniques》
: 盐浓度也很重要，很多蛋白－DNA都是salt dependent，而且不同蛋白需要的optimal盐
: 浓度不一样，比如SRF我们用150 mM盐，但是150mM盐做Forkhead的话，基本上都是非常
: 弱的binding，调到75 mM正好适合Forkhead。所以需要做个salt titration.
: 另外non-specific DNA的选择也非常重要，不同的non-specific DNA会给出不同的结果
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a*****n
发帖数: 2835 | 6 上P32试试？
【在 f*****e 的大作中提到】
: 一， 有对照，每次都正确出现，
: 二， 这套系统用过，另外的两个拿到了结果，shift和supershift。
: 三， 核抽提物都是一个方法，浓度保持基本稳定，分成小管， -80保藏，每次一个，
: 没有用纯化蛋白
: 四， 试过不同盐浓度，没有做梯度，应该试一下，实在不行就放弃了
: 谢谢
:
: extract
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f*****e
发帖数: 223 | 7 算了，现在对文章没追求，给别人打工混日子，不愿费那个劲，谢谢。不过，原来用
p32确实一次就出结果了
【在 a*****n 的大作中提到】
: 上P32试试？
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y*****5
发帖数: 567 | 8 我没用过你的Kit，看起来很麻烦。我就是用SRBY green 染色替代了P32。普通DNA，
加上protein后跑个胶， 拿SRBY green 染30分钟，洗干净，用UVlight 看照相。这样
跑出来的带不如p32的sharp。但是如果有问题你可以看到你的DNA都去哪了。 |
a****o
发帖数: 1786 | 9 sometimes the concentration of Mg is very important |
H*g
发帖数: 2333 | 10 我一直在用这个kit, 一直结果还好。 有shift, super-shift以及cold probe
competition。除了glycerol和NP-40, 你还需要调整Mg2+和K+的浓度。你的探针应该是
Biotin-labelled, 能具体说说“探针区域ChIP结果阳性”是什么意思吗？
【在 f*****e 的大作中提到】
: 用的是Pierce LightShift® Chemiluminescent EMSA Kit, 电泳用Biorad TBE
: precast Gel。 按照说明书改变过glycerol和 NP40的量，但总没有shift 和
: supershift的条带。探针区域ChIP结果阳性。 请教有啥高招啊
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