m******5
发帖数: 1383 | 1 1， 用imagin J设置scale bar for Zeiss observer.A1的各项参数在哪里找？ 很多牌
子的scale bar设置需要的参数在网上都能找到，就Zeiss的找不到
2，小弟用的红色荧光reporter是DsRed，在red channel下看很specific,形态很好，但
问题是在 blue和green channel下看也很明显。
后来问了管理员说这台显微镜的filter 就是不太行，听起来很安慰，但还是很难被
convince，想请教一下这个情况正常么？ (这个DsRed是knock-in到一个endogenous 启
动子下面的所以是弱信号，要不也不会这么纠结了) |
m******5
发帖数: 1383 | |
a*****x
发帖数: 901 | 3 第一个问题，可以用ZEN或者LSM读原始数据加Scale bar。如果用其他软件，根据像素
数目和显微镜参数也可以做。
第二个问题，怀疑光路设置有问题。比如选反射镜的时候可以控制反射的波长范围的，
可以降低在其他channel的信号。和pinhole及gain的设置也有关系。 |
m******5
发帖数: 1383 | 4 第一个问题，因为显微镜不是自己的，所以要等周一上班才能回去调，这周末要烦死了
第二个问题同样，我也怀疑什么设置出问题了，但又无权改。 别人看高表达信号强得
要命也不存在这个问题。 从表达pattern上来看make sense，但有一点不确定性也是很
难受的。 因为是knock-in工具，花了很长时间…… 也考虑过会不会是auto flurecent
，不过反而可能性不大，因为大多数auto flurecent都只在比较狭窄的channel.
包子稍后送上！
【在 a*****x 的大作中提到】
: 第一个问题，可以用ZEN或者LSM读原始数据加Scale bar。如果用其他软件，根据像素
: 数目和显微镜参数也可以做。
: 第二个问题，怀疑光路设置有问题。比如选反射镜的时候可以控制反射的波长范围的，
: 可以降低在其他channel的信号。和pinhole及gain的设置也有关系。
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m******5
发帖数: 1383 | |
m******5
发帖数: 1383 | 6 baozi sent!
【在 a*****x 的大作中提到】
: 第一个问题，可以用ZEN或者LSM读原始数据加Scale bar。如果用其他软件，根据像素
: 数目和显微镜参数也可以做。
: 第二个问题，怀疑光路设置有问题。比如选反射镜的时候可以控制反射的波长范围的，
: 可以降低在其他channel的信号。和pinhole及gain的设置也有关系。
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f*******e
发帖数: 628 | 7 DsRed 的 spectra 看上去 excitation 的确很 broad, 具体取决于你用的显微镜的
blue 和 green 的波段定义，但 DsRed 在一般蓝光绿光 490nm, 515nm 的地方都有不
是太弱的激发，是最大的 40% 和 70%，信号强的话完全可以引起足够观察到的信号。
然后你们那里的荧光显微镜 emission filter 可能用的是 long pass filter, 就是说
，只要 emission 比允许的 wavelength 更长就都能通过。通俗的说就是 DsRed 的红
光 emission 可以通过为了蓝光或者绿光设立的 emission filter (如果是 long pass
而不是 band pass 的话），从而被检测到。如果不是有多个 color 看 correlation
的话，问题不大。 |
x****u
发帖数: 530 | 8 借宝地搭车问问:
荧光显微镜看GFP标记细胞.转到白光后,显微镜里看到的细胞也是白色背景;但是拍出的
照片,背景却是绿色的,哪位高手能给个高招?
显微镜:Nikon TE200 inverted microscope
光源:白光
拍照软件:snapshot
谢谢啦! |
f*******e
发帖数: 628 | 9 通常显微镜的 camera 是没有 color discrimination 的，只有 gray level。照片出
来的颜色通常都是软件后期处理加上的 pseudo color，理论上 user 设置什么颜色，
就会出什么颜色。
【在 x****u 的大作中提到】
: 借宝地搭车问问:
: 荧光显微镜看GFP标记细胞.转到白光后,显微镜里看到的细胞也是白色背景;但是拍出的
: 照片,背景却是绿色的,哪位高手能给个高招?
: 显微镜:Nikon TE200 inverted microscope
: 光源:白光
: 拍照软件:snapshot
: 谢谢啦!
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x****u
发帖数: 530 | 10 谢谢啦
【在 f*******e 的大作中提到】
: 通常显微镜的 camera 是没有 color discrimination 的，只有 gray level。照片出
: 来的颜色通常都是软件后期处理加上的 pseudo color，理论上 user 设置什么颜色，
: 就会出什么颜色。
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s******e
发帖数: 370 | 11 从前用dsRed也碰到过类似问题，当时还兴冲冲的以为co－localization就此做成……
好像现在Tsien实验室已经不建议大家用这个荧光蛋白了，有可能的话换成mCherry？ |
a*****x
发帖数: 901 | 12 dsRed 是那个647nm激发的dye吗？我用的没有问题啊。。。
【在 s******e 的大作中提到】
: 从前用dsRed也碰到过类似问题，当时还兴冲冲的以为co－localization就此做成……
: 好像现在Tsien实验室已经不建议大家用这个荧光蛋白了，有可能的话换成mCherry？
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m******5
发帖数: 1383 | 13 ………………
【在 a*****x 的大作中提到】
: dsRed 是那个647nm激发的dye吗？我用的没有问题啊。。。
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m******5
发帖数: 1383 | 14 顶上去继续收集DsREd 的reputation
另外，有人用过DsRed expression2这个东西么？》 |
